细胞上清的培养基进一步诱导两天，促使DC细胞分化为DCl细胞。本发明方法制备的DCl细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7，⑶70，HLA-DR，⑶83，⑶86等DC细胞与免疫激活相关的标志物的多个表面标志物成阳性(如图1)。
[0033]上述过程均在体外进行，由此可获得富集DCl细胞的细胞群。DCl细胞经过⑶40L刺激之后，高表达IL12。IL12在T细胞特异性免疫激活过程中有至关重要的作用，本发明方案诱导的DCl激活特异性免疫反应的能力较常规方案的DC细胞要更强，如图2所示本发明制备而得的细胞产物IL12p70表达量大大高于目前常用的方案，本发明诱导的DCl细胞所分泌的IL-12几乎是常规方案制备的成熟DC细胞分泌量的10倍。
[0034]另一方面，由于DCl细胞的表型显示了其强有力的诱导CTL细胞的能力(如图3所示，体外诱导实验显示经本发明制备的DCl诱导之后，活化的T细胞即IFNy表达阳性的T细胞显著性升高)，DCl细胞负载特异性肿瘤抗原的短肽之后，可以用多种肿瘤治疗(肝癌，肺癌，乳腺癌等等)。负载肿瘤抗原的DCl细胞单独给药进行治疗，也可以与其他肿瘤治疗方法组合使用来治疗肿瘤，如，肿瘤外科手术、化疗(细胞毒性药物，凋亡试剂，抗体药物等等)、放射疗法、冷冻疗法、近距疗法和其他免疫疗法之一种或多种来组合使用。本发明的DCl细胞可以采用任何适于给药的剂型和方式进行给药，配制成注射剂进行给药。例如，可与药学上可接受的载体结合，通过注射器、导管、插管、皮下、静脉或淋巴结等给药。
[0035]另一方面，本发明还提供了一种体外诱导肿瘤特异性的CTL的制备方法。:分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0?3.0 X 16个/ml添加扩增培养基，至第五天加入诱导剂IFN- γ之后24小时，加入诱导试剂IL-1 α及⑶3并与DCl细胞混合培养。DC和T细胞混合培养后第二次添加扩增培养基时(混合培养后第3-4天)约在第10天-11天，进行第二次抗原肽负载。培养至在第十五天，收集细胞。CTL细胞的培养时间可以根据临床治疗的要求进行延长，一般不超过20天。
[0036]本发明方案获得的CTL细胞可以做为药物，通过注射的方式，患者肿瘤内、肿瘤近旁或邻近肿瘤的血管或淋巴管内或皮下。CTL细胞也可与肿瘤外科手术、化疗、放射疗法、冷冻疗法、近距疗法和其他免疫疗法来组合使用。组合使用时，不同的疗法可以同时或依次进行。
[0037]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0038]实施例1
[0039]自然杀伤细胞培养基上清(Natural Killer cell，NK)的制备
[0040]外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(Gene Ther.2003 10(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞。
[0041]按密度3X 106/ml转移至新培养瓶中，加入IL-2 (2000U/ml)以及IL15(2ng/ml)。每两至三天倍比加入培养基，并等量补加因子。至第十二天收集。诱导完成之后，NK细胞按 1-3 XlOfVml 接种至培养基 RPMI1640 中，加入 IFN a(1000UI/ml)并以 0.5-1.5X105/ml密度接种K562细胞(可替换为K562-NK细胞)混合培养，收集激活24-48小时过程中的培养基上清，过滤之后-80度冻存或直接用于DCl细胞的制备。
[0042]实施例2
[0043]成人外周血来源的一型极化树突状细胞的制备
[0044]外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(Gene Ther.2003 10(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。
[0045]按密度3.0X 1fVml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在含1000U/ml IL-2扩增培养基中加入10%血浆，置于37.(TC、饱和湿度、5% CO2环境中培养。培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-4 1000U/ml以及10%血浆的培养基。贴壁细胞培养第3
天，第5天更换一半量的培养基。
[0046]培养第六天，更换含5%血浆培养基并加入NK细胞上清10%，并按照终浓度1000UI/ml加入IFN γ，培养二十小时之后再加入20ug/ml的poly-1: C。培养至第七天收集细胞即为DCl细胞。DCls细胞培养至第六天，将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽段粉剂离心后(300g，1min)，每支分别溶于200ul培养基中(每个肽2ug/ml)，充分混勾后加入到DCl中，孵育2h。收集的DCl细胞分为两份，每份至少16个细胞，可以用于直接与肽混合回输病人体内，或用于体外诱导CTL细胞。
[0047]实施例3
[0048]DCl细胞体外诱导肿瘤抗原特异性CTL细胞
[0049]如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度3.0X 106/ml接种培养。每隔两天倍比添加含1000U/ml IL-2的扩增培养基。至培养第五天添加IFN-丫，第六天加入IL-1a与⑶3。
[0050]将由实施例2获得的抗原肽负载DCl与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加含1000U/ml的扩增培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽。将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽粉剂离心后(300g，1min)，每管分别加入Iml的培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过20天。
[0051]实施例4
[0052]本发明诱导的DCl细胞的临床应用
[0053]应用上述描述的方法，本发明针对肝癌病人采用了 DCl介导免疫疗法进行治疗方法简述如下:符合入选标准的患者(III或IV级)在进行化疗之前，取外周血150ml，按实施例二以及实施例三进行制备DCl以及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。
[0054]第七天在病人的淋巴结注射抗原负载的16个DCl细胞(重悬于Iml生理盐水)，第十六，十七，十八天每天回输19个诱导T细胞，静脉回输。目前已完成5例，治疗效果良好，尚未发现明显的并发症，证实本方法安全可靠。
[0055]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种体外诱导一型极化树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1，制备NK细胞的培养基上清:K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFN alpha，24-48小时后收集培养基上清； 步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4进行培养，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，获得成熟DC细胞； 步骤3，所述步骤2中制得的成熟DC细胞用含INF γ以及所述步骤I中的NK细胞的培养基上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DCl细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤I中制备NK细胞的培养基上清时，首先分离脐血/外周血单个核细胞，加入NK细胞诱导试剂，培养12-15天收集NK细胞；然后将收集的NK细胞接种至培养基中，并在培养基中加入激活因子IFNa并与Κ562细胞共培养24-48小时，最后收集培养基上清，于_80°C保存或直接使用。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，NK细胞与K562细胞的共培养的接种比例1:5 至 1:20。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的K562细胞可由K562-NK细胞替换。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的贴壁培养是指在含IL-2扩增培养基中加入10%血浆，置于37.(TC、饱和湿度、5% CO2环境条件下的培养。6.—种如权利要求1-5任意一项所述方法制备的一型极化树突状细胞。7.一种治疗肿瘤的组合物，其特征在于，由如权利要求1-5任意一项所述方法获得的DCl细胞进行肿瘤抗原肽负载而得到。8.一种制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，其特征在于，包括以下操作:分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0?3.0X 16个/ml添加扩增培养基，至第五天加入诱导剂IFN- γ培养24小时，然后加入诱导试剂IL-1 a及CD3并与权利要求7所述的负载了抗原肽的DCl细胞混合培养；混合培养后第二次添加扩增培养基时，进行第二次抗原肽负载；培养15-20天，收集细胞。9.如权利要求8所述的方法制备的肿瘤抗原特异性CTL细胞在制备抗癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用，利用脐带血自然杀伤细胞(Natural？Killer？cell，NK)在DC细胞激活适应性免疫过程中的辅助作用，建立了一种新的DC1细胞制备方法，制备过程减少了细胞因子的使用，降低了成本，提高了质量控制；同时本发明还提供了将制备的DC1细胞用于制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，DC1细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞(CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。
【IPC分类】A61P35/00, A61K35/15, C12N5/0784
【公开号】CN105219717
【申请号】CN201510684980
【发明人】李伟, 叶圣勤, 汪鑫, 瞿苏
【申请人】上海隆耀生物科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日