C片段与ATAC片段之一的限制性内切酶。 阳03U 上述试剂盒中还可W包括其它成分，例如PCR反应Mix(包括4种dNTP混合物、 Mg2\TaqDNApolymerase、TaqAntibody、缓冲液，DMS0和硫酸锭）和用于实施测定的说明 书等。
[0032] 本领域技术人员可W理解，除非有明显抵触，本发明的第一方面和第二方面的相 关特征可W相互组合。
[0033] 本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【附图说明】
[0034] 图1描述了根据本发明的方法获得的酶切产物电泳紫外照片。其中Marker是：标 准参考位置；泳道1:GG基因型；泳道2:AG基因型；泳道3:AG基因型。
【具体实施方式】
[0035] 下面对本发明进行详细描述。本领域技术人员应当理解，W下详细描述仅用于说 明而非限定本发明。
[0036] (1)待测DNA的获取
[0037] 采集不同人群外周血，提取基因组DNA后进行下面的化IN1基因rs2289487位点 多态性的测定。
[0038] 对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可W是从人体的体液或者组 织获得离体样本，还可W是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提 取离体样本。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少化IN1基因的组织，而与是否表 达该化IN1基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的，并 且可W参考常用的分子生物学手册，例如《分子克隆》第2版进行。
[0039] 似引物设计与合成
[0040] 查找NCBI网站的Gene数据库和SNP数据库，分别获得化IN1基因全序列和 rs2289487多态位点信息。rs2289487多态位点R前后部分碱基序列（碱基序列W5' 一 3' 表示，大小写意义相同）如下（SEQIDN0:1):
[0041 ]
[0043] 根据基因序列进行上游引物和下游引物设计，其中，下游引物引入错配碱基。在最 终所得扩增产物上，下游引物的错配碱基T与R的配对碱基之间相隔一个碱基A。
[0044] 在本发明中，下游引物具有错配碱基T，且长度为35~60bp。其中一个实施 例中，引物如下，上游引物：5'GTGATGGAGGAGAGTCTGGAAG3'（沈QIDN0:2),下游引 物：5'口'60：1^0：了00：了6了6了41'00：6 40：0：4(：了607^6；1>3'669 10側:3)，其中下游引物 下划线碱基为错配碱基。 柳例 做制备PCR扩增产物
[0046] 根据上游引物和下游引物特征及PCR相应试剂制定PCR扩增程序和条件，制备 PCR扩增产物。其中一个实施例中，取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为 0. 1 ~1μΜ)、2XPCRMix7. 5μL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸锭）和双蒸水共同组成15μL反应体系，调整溶液抑为7. 3 左右。PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性80s- 60°C退火80s- 72°C延伸20s共 30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0047] (4)酶切反应
[0048] 本发明可W采用Cviqi、RsaI内切酶，为化IN1基因rs2289487位点的多态鉴定提 供了多种可选择的内切酶，其价格与多态位点附近碱基无错配情况下可采用的内切酶BsmI 相比，非常低廉，实验时可W根据市场价格选择合适的内切酶。内切酶价格如表1所示。 W例表1肥B公司几种内切酶识别序列及其价格 阳化0]
[0051] 注：N为A或T或C或G 阳化引其中一个实施例中，取PCR产物10化，加入抓内切酶Cviqi、2yL10X酶切缓冲 液和7. 5μL双蒸水组成20μL反应体系，25°C水浴中酶切4~12h，即得酶切产物，酶切产 物经1倍浓缩后电泳观察。 阳〇5引 妨电泳测试
[0054]其中一个实施例中，PCR产物经Cviqi酶切后如果不能切开则仍为148bp，如果被 切开则出现l〇8bp和40bp(由于Cviqi酶切产生粘性末端使其互补链碱基数目不同，因此 切开后片段长度W基因序列上单链碱基数目为准来计算），其中40bp片段电泳图中难W分 辨。 阳化5] 将酶切产物在2~4%琼脂糖凝胶中3~8V/cm条件下，电泳30~80min，于紫外 灯下拍照测定。酶切电泳见图1，依据148bp和108bp片段的有无判断来判断基因型：AA型 为148bp-个片段，AG型有148bp、108bp片段，GG型为108bp-个片段。
[0056] 下面是实施本发明的若干实施例。
[0057] 实施例1提取人外周血白细胞DNA测定rs2289487多态性
[0058] 1材料与方法
[0059] 1. 1主要试剂及仪器
[0060]试剂：2XPCRMix(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸锭）（Vazyme公司），限制性内切酶Cviqi(肥B公司），琼脂 糖度iowest公司），引物由上海Sangon公司合成。
[0061]仪器：9600型PCR仪（阳公司），微型电泳槽（Pharmacia Biotech, EPS1000), Gel Doc 2000凝胶成像仪度io-RAD公司）。 阳06引 1. 2从外周血白细胞中提取DNA作为待测基因组DNA模板
[0063] 邸TA-K2抗凝管采集人外周血ImU参考《实用流式细胞术彩色图谱》中白细胞的分 离方法进行白细胞分离，参考《分子克隆》中氯化钢盐析法提取白细胞基因组DNA，并作为待 测人基因组DNA模板。
[0064] 1. 3序列查找及引物设计 W65] 在NCBI网站查找PLIN1基因序列和rs2289487多态位点信息来设计引物，具体如 下：
[0066]上游引物：5'GTGATGGAGGAGAGTCTGGAAG3'（沈QIDN0:2);
[0067]下游引物：5'CTGCCTCCCTGCCTGTGTATCCCGACCCCACTGCCTAG工A3'（沈QIDN0:3)
[0068] 1.4PCR扩增 W例 取基因组DNA巧0~80ng)、上下游引物（终浓度为0. 1~1yM)、2XPCRMix 7. 5μL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymerase、TaqAntibody、缓冲液，DMSO和 硫酸锭），灭菌双蒸水补足15μ1反应体系，调整溶液抑为7. 3左右。
[0070] PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s- 60°C退火30s- 72°C延伸20s 共30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0071] 1.5酶切鉴定 阳07引PCR扩增后，取PCR产物10μ1，加入抓内切酶Cviqi和2μ1 10X酶切缓冲液和 灭菌双蒸水组成20μ1反应体系，25 °C水浴中酶切4h后，即得酶切产物。
[0073] 上述酶切产物经1倍浓缩后，在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳40min，于紫外 灯下拍照鉴定多态类型。 W74] 2结果 阳0巧]2. 1PCR扩增结果
[0076] 扩增后序列（其位于SEQIDNO: 1碱基序列的394~541处，共148bp)，所获得 的扩增产物序列如下（SEQIDNO:4):
[0077]
[007引扩增后产物序列中下划线部分分别为上游、下游引物所对应的序列，R代表A/G多 态即SNP位点rs2289487。 阳0巧]2. 2酶切结果
[0080] 经内切酶Cviqi酶切后的产物序列分别如下：
[0081] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段108bp(该片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个碱基）序列（SEQIDNO:5):
[0082]
[0083] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段40bp(该片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个碱基）序列（SEQIDNO:6):
[0084] t曰ct曰邑邑C曰邑t邑邑邑邑tc邑邑邑曰t曰C曰C曰邑邑C曰邑邑邑曰邑邑C曰邑 40
[00化]酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，结果示于图1中。其中，rs2289487位点扩 增后出现148bp片断。经Cviqi酶切后电泳会出现148bp、108bp和40bpΞ种片断（其中 40bp在电泳图中不易分辨）。
[0086] 经Cviqi酶切后电泳进行基因型判断：如图1所示，AA型为148bp-个片段，AG型 有148bp和108bp两种片段，GG型为108bp-个片段。
[0087] 2. 3PLIN1基因rs2289487位点多态结果 阳0蝴共检测88例人员，检测结果发现rs2289487位点出现GG型31例、AG型27例和AA型30例。
[0089] 实施例2人外周血全血标本测定rs2289487多态性
[0090] 主要试剂及仪器同实施例1。参考《分子克隆技术》中酪-氯仿抽提法提取外周血 基因组DNA，并作为待测人基因组DM模板。
[0091] 序列查找同实施例1，设计引物序列如下：
[0092]上游引物：5'CGTGATGGAGGAGAGTCTGGAAGCTT3'（沈QIDN0:7);
[0093]下游引物：5'ACTGCCTCCCTGCCTGTGTATCCCGACCCCACTGCCTAG工A3'（沈QID NO:8)
[0094] 取基因组DM巧0~80ng)、上下游引物（终浓度为0.1~1yM)、2XPCRMix 10μL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\TaqDMpolymerase、TaqAntibody、缓冲液，DMSO和 硫酸锭），灭菌双蒸水补足20μ1反应体系，调整溶液抑为7. 3左右。 阳0巧]PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s- 60°C退火