20s- 72°C延伸20s共30个循环，72°C延伸lOmin。
[0096] 酶切鉴定：取PCR产物10μ1，加入抓内切酶Cviqi、2μ1 10X酶切缓冲液和灭菌 双蒸水组成20μ1反应体系，25 °C水浴中酶切地，即得酶切产物。酶切产物经1倍浓缩后， 在2.5%琼脂糖凝胶5￥/畑1条件下，电泳4〇111；[]1，于紫外灯下拍照鉴定。
[0097]结果：
[0098] 扩增后序列（其位于SEQIDNO:1碱基序列的393~542处，共15化P)，所获得 的扩增产物序列如下（SEQIDNO:9):
[0099]
[0100] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，R代表A/G多态即 SNP位点rs2289487。 阳101] 酶切后的产物序列分别如下： 阳102] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段109bp(该片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个碱基）序列（SEQIDNO:10): 阳103]
[0104] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段4化P(该片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个碱基）序列（SEQIDNO:11):
[0105]t曰ct曰邑邑C曰邑t邑邑邑邑tc邑邑邑曰t曰C曰C曰邑邑C曰邑邑邑曰邑邑C曰邑t 41
[0106] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs2289487位点扩增后出现150bp片断。 经Cviqi酶切后电泳会出现150bp、109bp和4化PΞ种片断（其中4化P在电泳图中不易分 辨）。
[0107] 经Cviqi酶切后电泳进行基因型判断：AA型为150bp-个片段，AG型有150bp和 109bp两种片段，GG型为109bp-个片段。
[0108] 多态结果：共检测96例人员，检测结果发现rs2289487位点出现GG型40例、AG 型19例和AA型37例。 阳109] 实施例3人外周血血凝块测定rs2289487多态性
[0110] 参考《分子克隆技术》中酪-氯仿抽提法提取血凝炔基因组DM。 阳11UPCR反应所采用的上游引物是沈QNO: 12,下游引物是沈QNO: 13。 阳 112]上游引物：5'ACGTGATGGAGGAGAGTCTGGAAGCT3'（沈QIDN0:12);
[0113]下游引物：5'TACTGCCTCCCTGCCTGTGTATCCCGACCCCACTGCCTAG工A3'（SEQID NO:13)
[0114] PCR扩增除退火溫度是59°C外，其余反应条件同实施例1;酶切鉴定同实施例1。 阳115] 结果：
[0116]扩增后序列（其位于SEQIDNO:1碱基序列的392~543处，共15化P)，所获得 的扩增产物序列如下（SEQIDN0:14): 阳117]
[0118] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，R代表A/G多态即 SNP位点rs2289487。
[0119] 酶切后的产物序列分别如下：
[0120] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段11化P(该片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2个碱基）序列（SEQIDNO:15):
[0121]
[0122] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段42bp(该片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少2个碱基）序列（SEQIDNO:16):
[0123]t曰ct曰邑邑C曰邑t邑邑邑邑tc邑邑邑曰t曰C曰C曰邑邑C曰邑邑邑曰邑邑C曰邑t曰42
[0124] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs2289487位点扩增后出现152bp片断。 经Cviqi酶切后电泳会出现15化p、110bp和42bpΞ种片断（其中42bp在电泳图中不易分 辨）。 阳1巧]经Cviqi酶切后电泳进行基因型判断：AA型为152bp-个片段，AG型有152bp和llObp两种片段，GG型为llObp-个片段。 阳1%] 多态结果：共检测80例人员，检测结果发现rs2289487位点出现GG型33例、AG 型16例和AA型31例。 阳127]实施例4人口腔黏膜细胞测定rs2289487多态性
[0128] 主要试剂除内切酶是Rsal外，其余同实施例1;仪器同实施例1。采用微量DNA提 取试剂盒对口腔黏膜细胞进行基因组DNA提取。 阳129] PCR反应所采用的上游引物是沈QNO: 17,下游引物是沈QNO: 18。 阳130]上游引物：5'GACGTGATGGAGGAGAGTCTGGAAGCTTCA3'（沈QIDN0:17); 阳 13U下游引物：5'TGCCTCCCTGCCTGTGTATCCCGACCCCACTGCCTAG工A3'（沈QIDN0:18)
[0132] PCR扩增除退火溫度是ere外，其余反应条件同实施例1 ;酶切鉴定除内切酶采用 Rsal酶外，其余条件同实施例1。 阳133]结果： 阳134] 扩增后序列（其位于SEQIDNO:1碱基序列的391~540处，共15化P)，所获得 的扩增产物序列如下（SEQIDN0:19): 阳135]
[0136] 扩增后产物序列中下划部分分别为上游、下游引物所对应的序列，R代表A/G多态 即SNP位点rs2289487。 阳137] 酶切后的产物序列分别如下：
[0138] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段112bp序列（SEQ IDNO:20)： 阳139]
[0140] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段38bp序列（SEQID NO:21)：
[0141] 曰ct曰邑邑c曰邑t邑邑邑邑tc邑邑邑曰t曰c曰c曰邑邑c曰邑邑邑曰邑邑c曰 38 阳142] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs2289487位点扩增后出现150bp片断。经 Rsal酶切后电泳会出现15化P、112bp和38bpΞ种片断（其中38bp在电泳图中不易分辨）。
[0143] 经Rsal酶切后电泳进行基因型判断：AA型为150bp-个片段，AG型有150bp和 112bp两种片段，GG型为112bp-个片段。
[0144] 多态结果：共检测122例人员，检测结果发现rs2289487位点出现GG型44例、AG 型38例和AA型40例。
【主权项】
1. 一种测定人PLIN1基因rs2289487位点多态性的方法，包括： 提供待测人基因组DNA; 提供扩增人PLIN1基因rs2289487位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引 物具有错配喊基T; 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得 含RTAC片段的扩增产物，其中R为人PLIN1基因rs2289487位点上的待定碱基A或G; 提供限制性内切酶； 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物； 以及根据所得酶切产物来确定人PLIN1基因rs2289487位点上的待定碱基R是A还是G， 其中，限制性内切酶为仅能够切开GTAC片段与ATAC片段之一的限制性内切酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在所得扩增产物上，下游引物的错配碱基T与R的 配对碱基之间相隔一个碱基A。3. 根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，下游引物末端碱基与R的配对 碱基相邻。4. 根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为仅能切开GTAC片段的CviQI或其 同裂酶、Rsal或其同裂酶。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长 度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产 物，通过判断酶切产物所包含的片段类型来确定人PLIN1基因位点rs2289487上的待定碱 基是A还是G。6. 根据权利要求5所述的方法，其中判断酶切产物所包含的片段类型是通过凝胶电泳 联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。7. 根据权利要求6所述的方法，其中参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经 紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中第一参照图像位 置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图像位置则针对的是切断后具有 较长片段的扩增产物。8. 根据权利要求1所述的方法，其中通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增 产物的总片段长度在100至300bp之间，并且下游引物的片段长度至少为35bp，使得酶切切 掉部分片段占总片段的长度的百分比超过20%。9. 一种用于测定人PLIN1基因rs2289487位点多态性的试剂盒，其包含： 用于PCR扩增人PLIN1基因rs2289487位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下 游引物具有错配碱基T以获得含RTAC片段的扩增产物，其中R为人PLIN1基因rs2289487 位点上的待定碱基A或G;以及 仅能够识别GTAC片段与ATAC片段之一的限制性内切酶。
【专利摘要】人PLIN1基因rs2289487位点多态性基因分型技术。该方法，包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人PLIN1基因rs2289487位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基T；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含RTAC片段的扩增产物，其中R为人PLIN1基因rs2289487位点上的待定碱基A或G；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人PLIN1基因rs2289487位点上的待定碱基R是A还是G。限制性内切酶为仅能够切开GTAC片段与ATAC片段之一的限制性内切酶。本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105256007
【申请号】CN201510615701
【发明人】路红显, 张成鹏, 高庆国, 李怡君, 段晓冉, 冯晓蕾, 姚武, 杨永利, 施学忠, 王威
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月24日