于基因全合成。
[0141] 2. 2全基因合成
[0142] 1)引物合成后以无菌水稀释，方法如下：
[0143] a)取引物管12000rpm离心2min，引物按100 μΜ的浓度稀释，-20°C保存；
[0144] b)取少量引物P2~P9混合成终浓度为10 μ M作为使用液；
[0145] c)取少量引物Pl和PlO混合稀释成终浓度为10 μ M作为使用液Ρ1/Ρ10 ;
[0146] 2)基因全合成，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下：
[0147] a)取I yL P2~P9混合引物作为模版，配制如下Overlap PCR体系：
[0149] 无菌水补足总体积为50uL
[0150] b)将以上PCR体系进行如下反应：
[0152] 反应结束后，降到室温。
[0153] 加入引物P1/P10,进行如下PCR反应：
[0155] 反应结束后，降至室温。
[0156] c) 1~2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，抗体重链基因回收440bp大小片段，轻 链基因回收400bp大小片段。
[0157] d)回收加尾（Pyrobest DNA polymerase不能在PCR产物3'端加尾A，所以不能 直接连接T载体），作如下10 μ L体系：
[0158]
[0159] 反应条件如下：72°C 20mins，反应结束后，降到室温。
[0160] e)取加尾产物，连接pGEM-TEasy载体：
[0162] 室温连接2h或者4 °C连接过夜，连接产物转化JM109大肠杆菌，涂布在含有 100 μ g/mL氨苄青霉素（终浓度）的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100 μ g/mL氨 苄青霉素（终浓度）的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒（博大泰克公司）提取质 粒，获得的质粒进行核酸测序鉴定。
[0163] 在上述步骤中，Overlap PCR扩增后经过琼脂糖凝胶电泳分析，获得特异大小的目 的条带（图1);产物经过回收、加尾、克隆等分子生物学技术，成功克隆入pGEM-TEasy载 体；经过测序鉴定，合成的基因与目的序列一致。
[0164] 琼脂糖电泳结果：VH约为440bp目的基因片段，Vk约为410bp目的片断，分别命 名为 MIL70/VH 和 MIL70/V κ。
[0165] 实施例3MIL70抗体的制备
[0166] 实验材料
[0167] 委托Hyclone加工的干粉培养基，经配制后用于宿主细胞的驯化、细胞株筛选以 及抗体制备过程中培养细胞，细胞筛选时向配置的培养基中加入从Sigma购买的蛋氨酸砜 亚胺（Methionine sulfoximine，MSX)，用从sigma购买的台盼蓝干粉自己配制成溶液后用 于进行细胞计数。
[0168] 方法和结果
[0169] 3. 1抗体真核表达载体的构建
[0170] 选择本申请人获得的表达载体pTGS-FRT-DHFR (专利授权号： ZL200510064335. 0)，去除潮霉素选择标签，通过PshAl和Xhol酶切位点加入GS (glutamine synthetase,谷氨酰胺合成酶）表达盒子，作为筛选标记；其中GS cDNA从表达GS的细胞 系CHO中通过RT-PCR获得。经过改造后的载体命名为GS载体。将获得MIL70抗体轻重链 可变区基因克隆载体用相应的内切酶消化（轻链可变区基因用ClaI和BsiwI消化，重链可 变区基因用EcoR I和Nhe I消化）后，与经相同内切酶消化的载体连接。经过转化等分子 生物学常用技术，构建获得真核表达载体。具体实施如下：
[0171] a)在实施例2中，将MIL70轻重链可变区基因构建到pGEM-TEasy载体中，获得的 载体分别命名为MIL70/V κ和MIL70/VH ;
[0172] b)取MIL70/VK用ClaI和BsiwI消化，得到MIL70轻链可变区基因；
[0173] c)取1 μ g GS载体，用ClaI和BsiwI消化。用T4DNA连接酶连接所得的经ClaI 和BsiwI消化的GS载体和用ClaI和BsiwI消化的抗体MIL70轻链可变区基因。连接产物 转化XLI-blue大肠杆菌，涂布在含有100 μ g/mL氨苄青霉素（终浓度）的LB琼脂培养基 上。获得的克隆在含有100 μ g/mL氨苄青霉素（终浓度）的LB液体培养基中培养，用质粒 提取试剂盒（天根生化公司）提取质粒。所提取的质粒经ClaI和BsiwI消化后，用1 %琼 脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有抗体MIL70轻链可变区基因的克隆。获得的携带抗体 MIL70轻链可变区基因的质粒命名为pTGS-MIL70VK。
[0174] d)取MIL70/VH用EcoR I和Nhe I消化，得到MIL70重链可变区基因；
[0175] e)取1 μ g pTGS-MIL70V κ载体，用EcoR I和Nhe I消化。用T4DNA连接酶连接所 得的经EcoR I和Nhe I消化的pTGS-MIL70V κ载体和用MIL70/VH载体消化的抗体MIL70 重链可变区基因。连接产物转化XLI-blue大肠杆菌，涂布在含有100 μ g/mL氨苄青霉素 (终浓度）的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100 μ g/mL氨苄青霉素（终浓度）的LB 液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒（天根生化公司）提取质粒。所提取的质粒经EcoR I和Nhe I消化后，用1%琼脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有抗体MIL70重链可变区基 因的克隆。
[0176] 在PTGS-MIL70VK基础上获得的携带抗体MIL70重链可变区基因的质粒命名为 MIL70。
[0177] 3. 2宿主细胞岩藻糖敲除及悬浮驯化
[0178] 将从ATCC购买的CHO-Kl细胞进行gft基因的敲除使其自身表达的蛋白几乎或 完全不具有岩藻糖基化修饰，获得岩藻糖敲除宿主细胞命名为CH0K1-AF，具体方法是通过 基因工程技术改造表达系统，定点敲除抗体表达宿主细胞CHO-Kl中岩藻糖修饰途径的关 键蛋白GFT，从而有效降低抗体岩藻糖修饰水平。该方法可以同时阻断岩藻糖基化经典途 径及补偿途径，从而达到完全去除岩藻糖基化的目的。具体技术路线如图2所示，利用锌 指酶技术，针对GFT基因 SLC35cl的序列（编号GenBank:BAE16173. 1)优化设计了两个 GFT zinc-finger nuclease 锌指酶序列 G1F1、G2F2(其中 G1、G2、F1、F2 的序列分别如 SEQ ID N0:9、10、ll、12所示），用以分别结合目的基因的双链DNA。构建相应的表达载体质粒 PCDNA3. 1-G1F1、pCDNA3. 1-G2F2,并将两个质粒共转染CHO-Kl细胞。利用糖结合凝集素 LCA(Lens culinaris agglutinin)对蛋白岩藻糖基的特异性亲和力，将共转染后的细胞使 用biotin-LCA染色、结合anti-biotin microBeads和MACs LD柱进行负性分选，进一步克 隆化培养，利用流式技术分析细胞克隆岩藻糖敲除水平；经多轮负性筛选、克隆化培养，获 得了不含岩藻糖修饰的克隆1G7。流式细胞术结果显示，与原宿主细胞CHO-Kl相比，1G7细 胞表面岩藻糖的表达显著下降（图3)。提取1G7细胞总RNA，反转录后调取GDP转运蛋白编 码基因，经测序确认该基因突变成功，不能正常表达。将获得的细胞克隆命名为CH0K1-AF。
[0179] 进一步按图4所示流程进行驯化培养，将岩藻糖敲除的宿主细胞CHO-Kl在 种子培养基（参见表1 一 1)(含10 %小牛血清）中进行贴壁培养，逐级去除血清 (10% ->5% ->2. 5 % ->1. 25% ->完全不含血清），转置摇瓶培养，继续传代数次后，宿 主细胞完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在种子培养基中生长的稳定宿主细胞。宿主 细胞驯化过程中细胞生长的结果如图5所示。
[0180] 3. 3特有培养基的制备
[0181] 按照表1-1、1-2、1-3成分进行培养基的配制。经0.22 μπι膜无菌过滤后，供细胞 培养使用。
[0182] 表1-1 :种子培养基
[0184] 表卜2 :生产培养基
[0186] 表1-3:流加培养基
[0187]
[0188] 3. 4MIL70抗体的制备
[0189] 使用电转染方法将步骤3. 2获得的MIL70抗体真核表达载体转入目的宿主细胞 (实施例3步骤3. 2筛选获得的宿主细胞）中，向种子培养基中加入75 μ M MSX，在37°C CO2 培养箱中培养2~4周，挑选出可以在此培养基中存活的细胞，通过ELISA法检测获得能够 表达抗体的细胞。经过有限稀释法进行亚克隆筛选，经过6~8周的培养及筛选，获得能够 高效表达MIL70抗体的单克隆细胞株。
[0190] 细胞株经过培养基多步的扩大培养，接种密度为0. 5X106cellS/ml，每三天传代 一次，扩充至足够细胞量后转移至发酵培养基（培养基为生产培养基：种子培养基（I :1))， 在发酵培养基中的培养周期为12-14天，培养第3、6、9天加入10 %体积的流加培养基，培养 结束后收获上清，将上清进行纯化。
[0191] 采用AKTA(GE公司）进行MIL70抗体的分离纯化。首先收集过蛋白A亲和层析柱 (MabSelect SuRe) pH在3. 4-3. 6范围（用280nm进行监测）的洗脱液，调pH值至8. 0,上 样到阴离子交换层析柱（Q-Sepharose FF)，280nm进行监控和收集样品。将收集液pH值调 节至5. 5,上样到阳离子交换层析柱（Poros)收集样品。超滤浓缩后获得MIL70抗体。具体 流程如图6所不。
[0192] 按照上述方法制备得到的抗体MIL70用于以下各实施例。
[0193] 实施例4MIL70抗体的分析以及活性鉴定
[0194] 实验材料
[0195] 用从Thermo购买的离子交换色谱柱（型号：Propac WCX-10, 4. OmmX 250mm，生产 商：戴安公司）进行离子交换色谱（简称IEC)分析，从sigma购买的HEPES、以及从国药集 团购买的NaCl配置IEC流动相，上海雅心生物技术有限公司购买的羧肽酶（CpB)进行样品 处理。
[0196] 用从TOSOH购买的凝胶色谱柱（型号：TSK-GEL SW3000, 7. 8mmX300mm，生产商： T0S0H)进行尺寸排阻色谱（简称SEC)分析，从国药集团购买的磷酸钾以及氯化钾配置SEC 流动相。
[0197] 4. 1MIL70抗体的分析
[0198] 4. I. 1MIL70抗体的等电点及电荷变量测定分析（iCIEF法）
[0199] 实验方法：
[0200] 8M尿素溶液及样品溶液的配制：
[0201 ] 8M尿素溶液：准确称取2. 4g尿素溶解于少量纯水，并定容至5. Oml，振荡混匀。
[0202] 2mg/ml的样品溶液：取10mg/ml样品溶液30 μ 1，加入浓度为lmg/ml的CpB酶溶 液3 μ 1，加入超纯水117 μ 1，振荡混匀。在37°C水浴30min，冷却至室温，待用。
[0203] 按照表2配制进样溶液：
[0204] 表 2
[0206] 将上述溶液在12000rpm条件下，离心3分钟。量取160 μ 1上层清液并加入内插 管中，将内插管置于离心管中，在12000rpm条件下，再离心3分钟，将内插管放入样品瓶中 待测。
[0207] 等电聚焦电泳条件见表3 :
[0208] 表 3
[0210] 仪器及其他参数见表4 :
[0211] 表 4
[0213] 实验结果：
[0214] MIL70样品与原研药Erbitux等电点及电荷异质性（icIEF法）检测结果见表5 :
[0215] 表 5
[0217] 可以看出，抗体MIL70具有更高的主峰比例。
[0218] MIL70样品与Erbitux (CAS No. 205923-56-4,杭州海正提供）icIEF测定谱图叠加 图如图7。可以看出，抗体MIL70具有更高的主峰比例。
[0219] 4. L 2MIL70抗体的体积排阻色谱（SEC)
[0220] 方法：
[0221] 参照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录III D分子排阻色谱法，凝胶色谱 柱为TSK-GEL G3000SWxl 7. 8 X 300mm，流动相为0. 2M磷酸钾缓冲液、0. 25M的氯化钾（pH 6. 2)，流速为0. 5ml/min，进样器：6°C，柱温：30°C，波长280nm检测，运行时间30min，本品 用流动相稀释至2mg/ml，进样25 μ 1。
[0222] 实验结果:
[0223] 结果如图8和如表6所示，Erbitux出峰时间略早，且主峰后有肩峰存在，表明其 分子大小异质程度高于MIL70, MIL70单体的比例高于ERBITUX。
[0224] 表 6 MIL70 与 ERBITUX 的 SEC 检测结果
[0226] 4. I. 3MIL70抗体毛细管电泳检测（非还原CE-SDS和还原CE-SDS)
[0227] (1)非还原 CE-SDS
[0228] 实验方法：
[0229] 样品和其他洛液制备：
[0230] IM碘乙酰胺溶液：称取185mg碘乙酰胺粉末溶于Iml水中，振荡混匀，分装，_80°C 保存，备用。
[0231 ] 按照表7制备进样溶液：
[0232]表 7
[0234] 将上述溶液振荡混勾，在70°C水浴lOmin，冷却至室温，在12000rpm条件下，离心 2分钟，量取80 μ 1上层清液并加入内插管中，将内插管放入样品瓶中待测。
[0235] 检测条件见表8:
[0236] 表 8
[0238] 实验结果：
[0239] MIL70样品与Erbitux纯度（非还原CE-SDS法）检测结果见表9 :
[0240] 表 9
[0241]
[0242] MIL70样品与Erbitux非还原CE-SDS测定谱图叠加图如图9。
[0243] 可以看出，抗体MIL70具有更高的主峰比例，因而纯度