更高。
[0244] (2)还原 CE-SDS
[0245] 实验方法：
[0246] 按照表10制备进样溶液：
[0247] 表 10
[0249] 将上述溶液振荡混勾，在70°C水浴lOmin，冷却至室温，在12000rpm条件下，离心 2分钟，量取80 μ 1上层清液并加入内插管中，将内插管放入样品瓶中待测。
[0250] 检测条件见表11:
[0251] 表 11
[0253] 实验结果：
[0254] MIL70样品与Erbitux纯度（还原CE-SDS法）检测结果见表12 :
[0255] 表 12
[0257] MIL70样品与Erbitux还原CE-SDS测定谱图叠加图见图10。
[0258] 4. I. 4MIL70抗体的糖型分析和完整蛋白分析
[0259] 4. 1. 4. 1抗体糖型分析
[0260] 糖型分析：
[0261] 主要设备与试剂见表13和14。
[0262] 表 13
[0266] 样品制备
[0267] 取抗体2mg，以IOkD超滤管除盐，将其体系中的盐浓度稀释25倍以上，并控制体积 为90 yL，加入10 yL G7PNGaseF酶切缓冲液、2. 5 yL PNGaseF，混匀后用封口膜封好，置于 37°C水浴锅内温浴12~18hr。
[0268] 温浴结束后，取出样品，在样品中加入-20°C预冷好的300 μ L无水乙醇，混匀，4°C 放置30min后，12000rpm离心5min，吸取上清150 yL至I. 5ml离心管内，置于真空离心浓 缩仪中，2000rpm浓缩干燥直至没有液体，浓缩过程中温度不超过35°C。
[0269] 待样品中的液体蒸发完全后取出，加入DMSO和乙酸混合液（350:150): 2_AB:Reductant = 100 μ L:5mg:6mg的比例混合液10 μ L。用封口膜封好，用锡纸包裹避光， 放入65°C烘箱中，衍生反应3小时。结束后，每个样品加入40 μ L流动相A和160 μ L流动 相Β，充分混勾，12000rpm离心3min，取上清上样分析，样品不可冻融。液相设置
[0270] 溶液配置
[0271] 流动相 A(K)OmM 甲酸铵 ρΗ4· 5):
[0272] 称取6. 31g甲酸铵，加入800mL超纯水溶解，用甲酸调pH值至4. 5,定容至1L，用 0. 22 μ m滤膜过滤，超声脱气20min，有效期1周。
[0273] 流动相B (100 %乙腈）：
[0274] 量取IL乙腈，超声脱气20min，有效期1周。
[0275] 色谱条件-标准色谱条件信息见表15 :
[0276] 表 15
[0278] 注：进样量与增益设置相关，一般建议增益为8时，进样量10 μ 1。如果样品量少， 可调整增益以及进样量，以不超过荧光检测器最大量程为准。梯度洗脱时间见表16 :
[0281] MIL70和ERBITUX的糖型，如图11所示。二者的主要糖型结果如表17和表18所示， 其中MIL70含有岩藻糖的糖型比例< 1.8%，且糖型以G0、G1、G2等简单糖型为主；ERBITUX 含有更复杂的糖型（Jun Qian, et al, Analytical Biochemistry, 364 (2007) 8-18·)。
[0282] 表17 MIL70的主要糖型比例
[0284] 表18 ERBITUX的主要糖型比例
[0286] 4. L 4. 2完整蛋白分析
[0287] 主要设备见表19 :
[0288] 表 19
[0289]
[0290] 主要试剂见表20:
[0291] 表 20
[0293] 方法：
[0294] 本品利用R1/20色谱柱进行脱盐.
[0295] 液相分离条件如表21所示：
[0299] 洗脱梯度见表22 :
[0300] 表 22
[0301]
[0302] 肽图质谱采集参数如下：
[0303] Scan Mode: None
[0304] Scan Type:Positive TOF MS
[0305] Intensity Thres. :lcps
[0306] Settling Time:0. 000ms
[0307] MR Pause: I. 082ms
[0308] MCA: No
[0309] GSl :55. 00
[0310] GS2:55. 00
[0311] CUR: 35. 00
[0312] TEM :400. 00
[0313] ISVF:5500. 00
[0314] TOF Masses (Da) : Min = 600. 0000 Max = 4000. 0000
[0315] Accumulation Time (sec) :0· 5000
[0316] Time Bins to Sum:40 Channels:I 234
[0317] 结果与分析
[0318] 将本品色谱柱脱盐后，TripleTOF 4600 (AB Sciex)质谱分析，本品的完整蛋白分 子量见表23和图12。MIL70检测到的完整蛋白中主要的糖修饰类型为：G0/G0、G0/G1和 (G1/G1)或（G0/G2)糖型修饰，其中G0/G0为最主要的完整蛋白类型，且其末端赖氨酸大 部分被切除（-K/-K);与理论的分子相比，MIL70主要组分G0/G0糖型的完整蛋白误差为 I. ID (7. 4ppm)，对于分子量在150kD的左右的抗体蛋白而言在质谱仪器测定误差范围内， 故本品的完整蛋白分子量与其理论值一致。
[0319] 而Erbitux由于含有两个糖基化位点，完整蛋白分子分布更为复杂，与MIL70 显著不同（Daniel Ayoub, Wolfgang Jabs, Anja Resemann, et al. (2013)Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques，mAbs，5:5, 699-710)〇
[0320] 表23 MIL70的完整蛋白分子量
[0321]
[0322] 4. I. 5肽段覆盖率
[0323] 主要设备见表24:
[0324] 表 24
[0326] 主要试剂见表25:
[0330] 样品制备：
[0331] 变性及烷基化
[0332] 将40 μ L样品（25mg/ml)与20 μ L IM的DTT和960 μ L的变性缓冲液（6M盐酸 胍，360mM Tris，2mM EDTA，ρΗ8. 6±0. 1)混合，得到稀释浓度为lmg/ml样品，短暂涡旋后， 在37°C下水浴lh。取出样品冷却到室温。加入50 μ L的IM碘乙酸溶液，短暂涡旋至混合 均匀，在室温下避光孵育15min。取出样品，加入10 μ L IM的DTT淬灭烷基化反应。
[0333] 置换缓冲液
[0334] 用至少 25ml 消化缓冲液（25mM Tris，2mM CaC12，pH 8. 2)平衡PD-10 柱；加载 Iml 的样品或空白溶液到ro-ΙΟ柱，弃去洗脱液；加入I. 5ml消化缓冲液并使其流下，弃去洗脱 液。
[0335] 加入2. Oml消化缓冲液，收集含有样品的消化缓冲液。短暂涡旋。
[0336] 消化
[0337] 向每个小管（20 μ g/管）加消化缓冲液200 μ L，重新设定酶的浓度为100 μ g/ml。 短暂涡漩将250 μ L的胰蛋白酶溶液加入到2ml的小样中。短暂涡旋，在37±2°C下孵育 5h±15min;在每管小样（2. Oml)中加入68 μ L 10% TFA溶液淬灭消化反应。短暂涡旋。
[0338] 保存
[0339] 酶切的样品在分析之前，可以在2_8°C下保存72h，或者在_70°C下保存2周。
[0340] 液相设置
[0341] 溶液及流动相配制
[0342] 流动相A :将1.0 ml FA加入到IL纯水中，搅拌。室温保存，保质期1周；
[0343] 流动相B :将1.0 ml FA加入到IL乙腈中，搅拌。室温避光保存在玻璃容器中，保 质期1个月。
[0344] 标准色谱条件见表26:
[0345] 表 26
[0347] 洗脱梯度见表27 :
[0348] 表 27
[0349]
[0350] 肽图质谱采集参数如下
[0351] 一级质谱参数如下：
[0352] Duration: 159. 996mins
[0353] Cycle Time: I. 8011secs
[0354] #Cycles:5330
[0355] Period Delay:。· OOsecs
[0356] Scan Mode:None
[0357] Scan Type:Positive TOF MS
[0358] Intensity Thres. :lcps
[0359] Settling Time:0. 000ms
[0360] MR Pause: I. 067ms
[0361] MCA: No
[0362] GSl :55. 00
[0363] GS2:55. 00
[0364] CUR: 25. 00
[0365] TEM:550. 00
[0366] ISVF:5500. 00
[0367] TOF Masses (Da) : Min = 350. 0000 Max = 2500. 0000
[0368] Accumulation Time (sec) :0· 2500
[0369] Time Bins to Sum:4 Channels:I 234
[0370] Ql Mass (Da) % Time Param Start Stop 330 00 50 0 DP 100.00 100.00 CE 10.00 10.00 XAl 175.23 175.23 Ql Mass (Da) % Time Paratn Start Stop 650.00 50.0 DP 1Q0.0Q 300.00 CE 10.00 10.00 mi 175.23 175.23
[0371] 二级质谱参数如下：
[0372] Scan Mode:None
[0373] Scan Type:Positive Product Ion
[0374] Product of Peak:IDA
[0375] Resolution Ql:UNIT
[0376] Intensity Thres. :0cps
[0377] Settling Time:0· 000ms
[0378] MR Pause: I. 067ms
[0379] MCA: No
[0380] GSl :55. 00
[0381] GS2:55. 00
[0382] CUR :25. 00
[0383] TEM :550. 00
[0384] ISVF:5500. 00
[0385] TOF Masses (Da) : Min = 100. 0000 Max = 2500. 0000
[0386] Accumulation Time(sec):0. 1000
[0387] Time Bins to Sum:4 Channels:I 234
[0388] Q2 Mass (Da) % Time Param Start Slop 80.00 50.0 DP 100 00 i 00.00 CE 0.00 0.00 CES 5.00 5.00 ΙΚ? 30.00 30.00 IMW 15.00 15.00 XAl 70.16 70.16 Q2 Mass (Da) % Time Param Start Slop 250.00 50.0 DF !00,00 i 00.00 CE 0.00 Q,：〇p CE：S 5.00 5,00 IRD 30.00 30.00 IRVV 15.00 15.00 XAl 70.16 70.16
[0389] 数据分析
[0390] Absciex BiopharmaBeta 软件分析，按照 m/z Tolerance: ± IOppm 选取肽段，选择 一次漏切，加修饰（见表28)进行搜库。
[0391] 表 28
[0393] 结果
[0394] 将MIL70胰蛋白酶酶解后，经LC-MS/MS分析发现MIL70的肽段覆盖率为95. 6%， 其中重链的覆盖率为94. 2%、轻链为98. 6%。绝大部分理论序列都得到质谱的鉴定，没有 鉴定到的肽段为DNSK、VDK、SPK、TKPR等短肽或亲水性强的肽段，在反相色谱里与色谱柱溶 剂峰一同流出，不在质谱数据收集的时间段之内。
[0395] 而针对ERBITUX的序列进行肽段检索可以发现，未检出【QVQLK】、 【MNSLQSNDTAIYYCAR】和【TNGSPR】三个肽段。（图I 3)
[0396] 4. 2MIL70抗体活性分析
[0397] 4· 2. 1MIL70抗体Clq结合活性分析
[0398] 实验方法
[0399] 用碳酸包被缓冲液（pH 9. 6)稀释MIL70抗体和Erbitux，当稀释至250 μ g/ml时， 进行3倍的梯度稀释获得10个浓度点，将稀释样品100 μ 1/孔包被，4°C孵育过夜。第二天 洗板后以200 μ /孔的PBST+0. 1 %明胶在37°C封闭1小时。洗板后将Clq蛋白用PBST+0. 1 % 明胶稀释液稀释至2 μ g/ml，以