[0087] (6)在每个EP管中加入100yL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮， 禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80°C保存。
[0088] 5、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序
[0089] (1)从-80°C冰箱中取100yL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
[0090] (2)将4.5yL回收的PCR产物、1.5yL pMD18-T(Simple Vector)和4yL Solution I 转化酶(TaKaRa公司生产)加入100yL感受态细胞中混匀，16°C水浴连接3h。
[0091] (3)加入连接后的重组DNA溶液轻轻摇勾，冰上放置30min。
[0092] (4)42°C水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。
[0093] (5)向管中加入lmL LB液体培养基(不含氨苄青霉素），混匀后37°C、250rpm振荡培 养lh，使细菌恢复正常生长状态，以表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。
[0094] (6)取lmL上述菌液6，000rpm离心5min，去除约lmL上清，剩下的混勾。取100yL涂布 于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培 养皿，37°C培养16~24h。
[0095] (7)用接种环挑选长出的单菌落放于lmL LB培养基(加入lyL氨苄青霉素，终浓度 为100yg/mL)中，37°C、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4~10h)，每组选取1个送去测序。
[0096] 测序得到Streptomyces Sp.H31木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下： [0097] (a)核苷酸序列如SEQ ID如：3所示（25你？）：
[0098] (b)NCBI核苷酸序列比对结果
[0099]将该核苷酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与同为10家 族的木聚糖酶（Streptomyces davawensis strain JCM 4913)具有88%的较高相似性，可 推断克隆的保守序列所在的基因属于10家族木聚糖酶基因。比对结果见图5。
[0100] 6、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因
[0101 ] (l)TAIL-PCR是为了得到Streptomyces sp.H31木聚糖酶基因保守序列上游和下 游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据Touchdown PCR 产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性 引物（Upstream primer，简称USP)和下游特异性引物（Downstream primer，简称DSP)各有3 个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出4对随机引物(Arbitrary degenerate primer，简称AD)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。
[0102] 表1 Streptomyces SP.H31木聚糖酶基因保守序列及用于TAIL-PCR的引物
[0103]
[0104]
[0105] (2)TAIL-PCR克隆上游基因
[0106] 使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反 应体系配制PCR反应液： 細 20 17.5'uL: lOxPCR Buffer 2.5 liL； dNTP Mixture 2μ1-.; 投:板 DNA 0.5 .uL；
[0107] AD 3 'uL; USP1 0.25 μL； Ex Taq 酶. 0.25 μL； Tola! 25 ^iL/Sample (?;?·ι''ι)
[0108] 然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：
[0109]
[0111] 弟二轮TA1L-PCK反应体糸冋弟一轮，但是将弟一轮反应的PCR产物用ddH20稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2,反应条件如下：
[0110]
[0112]
[0113] 第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH20稀释 100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3,反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1% 琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。
[0114] 通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD2进行TAIL-PCR，克隆出 Streptomyces sp.H31木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图6所示。从 图6中可以看出，经过3轮PCR，第4泳道出现的明显条带只有一条，大小约为500bp，符合目标 基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
[0115] 经过测序，Streptomyces Sp.H31木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下 (519bp):其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0116] (3)TAIL-PCR克隆下游基因
[0117] 反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性 引物。反应结束后，采用1 %琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。
[0118] 通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD1进行TAIL-PCR，克隆出 Streptomyces sp.H31木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图7所示。从 图7中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为2000bp，符合目标基 因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
[0119] 经过测序，Streptomyces Sp.H31木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下 (2017bp):其核苷酸序列如SEQIDNo :5所示。
[0120] 7、获得Streptomyces sp.H31木聚糖酶基因全长序列
[0121] 根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到 Streptomyces sp.H31木聚糖酶完整的酶基因序列。其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0122] 中性内切木聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(0RF)，该开放阅读框以起 始密码子ATG开始而以终止密码子TGA结束，共包括1380个核苷酸。其中，前66个核苷酸为信 号肽编码序列。
[0123] 中性内切木聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N〇:2所示。
[0124] 经DNAssist Version 2.2软件分析得到，中性内切木聚糖酶基因开放阅读框编码 459个氨基酸，其中，前22个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Leu22位 点被切除。因此，成熟的酶蛋白，共计437个氨基酸，其理论分子量(Mfft)为46.9kD，酶蛋白的 等电点(pl)8.18。
[0125] 将该氨基酸序列在NCBI数据库进行比对(BLAST)，发现该氨基酸序列与同为10家 族的木聚糖酶（Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486)具有最高的同源性，其相 似性仅为78%，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。比对结果具体 见图8。
[0126] 根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断， 中性内切木聚糖酶基因 XYN-H31为一新发现的内切β-l，4-木聚糖酶基因。
[0127] 实施例2
[0128] (一)材料
[0129] 1、菌种：嗜喊链霉菌Streptomyces sp ·Η31 菌株(CCTCC No :Μ 2015003)。宿主菌 E.coliBL21 Star(DE3)、E.coli Τ0Ρ10Κ 均购自 Invitrogen公司；
[0130] 2、载体：大肠杆菌表达载体pET_28a( + ) (Novagen，KanR)购自Novagen公司；载体图 谱见图9,其多克隆位点图见图10。
[0131] 3、培养基及缓冲液
[0132] (1)选择培养基：木聚糖8.(^/1，咖031.(^/1，]\%3〇4.7!1 20 0.58/1，他(：1158/1， KH2P0U · 5g/L，固体培养基加琼脂15~20g/L，pH 9 · 0;
[0133] (2)LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂 15~20g/L，pH 9.0，121°C高压灭菌20min。
[0134] (3)TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0，lmmol/L EDTA，pH8.0〇
[0135] (4)碱裂解液I、II、III (质粒提取）：碱裂解液I:葡萄糖50mmol/L，Tris-HCl (pH 8 · 0)25mmol/L，EDTA 10mmol/L。每瓶约100mL，灭菌后4°C|C存。喊裂解液II :Na0H 0 · 2mmol/ L，SDS 1 % (w/v)。溶液不可贮存，现用现配。碱裂解液III:乙酸钾5mmo 1 /L，冰乙酸11.5% (v/v) 〇
[0136] 4、主要试剂:△(：巧1&11^(16、1'1，1'1-甲叉双丙稀酰胺由361^&进口分装。0嫩聚合酶、限 制性内切酶、DNA分子量标记、Τ4连接酶为宝生物公司产品；1^8〇2}〇116(0他86 1^'^186 11〇11-(^七6(^6(1，>70,0001]/1^)、1?了6、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(3303)为上海生工生物 工程公司产品；蛋白分子量标记为Fermentas (ΜΒΙ)公司产品；PCR引物合成由上海生工完 成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成;基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回 收试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品。
[0137] 5、仪器：Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies 公司、DNA及蛋白电泳系统为Bio-ra