d公司产品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公 司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品;Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司 产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
[0138] (二)实验方法和结果
[0139] 1、目的基因的分离
[0140] 采用PCR的方法从Streptomyces sp.H31菌中分离目的基因。在37°C，220r/min摇 瓶培养Streptomyces sp.H31菌，72h后离心收集菌体，然后利用The E.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。根据目的基因，设计引入EcoR I和Xho頂每切位点（下划 线)的PCR引物：
[0141] 所述的PCR的所用的引物的序列：
[0142] 上游引物：5' -CCGGAATTCATGCCCAACGATTCGTTAGACAGGCGCAAG-37 ；
[0143] (下划线的序列表示的是EcoR頂每切位点）
[0144] 下游引物：5' -CCGCTCGAGTCAgtgatggtgatggtggtgGGAGACGGAACAGGCTCCGA-37 ；
[0145] (下划线的序列表示的是Xho頂每切位点，小写为6 XHis标签）
[0146] 所述的PCR的反应体系为：
[0147] 使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反 应体系配制PCR反应液：
[0148]
[0149] 所述的PCR的反应条件为：[0150] 然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
[0151]
[0152] 米用1 %埸脂概激収电冰对心K广彻进仃恨测。
[0153] 反应完成后，取8yL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。由图11可见，PCR扩增产物 的大小约为1400bp，与XYN-H31基因大小相符。将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen 公司进行测序鉴定。测序结果表明所扩增的序列与目的基因的序列一模一样。
[0154] 2、重组质粒的构建
[0155] 将克隆得到XYN-H31基因经EcoR I和Xho I双酶切后与采用同样酶切的大肠杆菌 表达载体pET-28a (+)连接，得到重组质粒pET-28a-XYN-H31。
[0156] 连接反应体系如下：
[0157]
[0158] 16°C水浴中连接过夜后转化感受态细胞(连接反应中基因和质粒的摩尔比为9: 1)〇
[0159] 3、E.coli T0P10F'和E.coli BL21Star(DE3)感受态细胞的制备
[0160] (a)接种E.coli T0P10F'和E.coli BL21Star(DE3)至LB培养基中，240r/min、37°C 培养过夜；
[0161 ] (b)吸取0. lmL菌液至 10mL LB培养基中，300r/min、37°C培养至0D600达0.5~0.7;
[0162] (c)吸取lmL 0D600达0 · 5~0 · 7的菌液至1 · 5mL离心管中，12000r/min离心2min，彻 底去除上清；
[0163] (d)加入100yL冰预冷的SSCS(-步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物 工程公司产品），轻悬菌体即制成感受态细胞。可立即转化或于-70°C冻存。
[0164] 4、转化E.coli T0P10F'感受态细胞
[0165] (a)10yL连接产物与100yL感受态细胞混匀，冰浴30min;
[0166] (b)42°C 水浴 90 秒，冰浴 2min;
[0167] (c)加入lmL LB培养基，混匀，37°C180r/min温浴lh;
[0168] (d)3000r/min离心lmin，吸底部沉淀200yL至LB(含选择抗生素 Kan，终浓度为50μ g/mL)平板，用涂布器涂匀，37°C培养过夜。同时做两个对照：
[0169] 对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
[0170] 对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5yL菌液涂布于不含 抗生素的LB平板上。
[0171] 5、转化子的培养及检测
[0172] (a)转化16h后，观察实验组的平板，看是否长出菌落(没有的话就继续培养或者重 新做转化），然后用标记笔在培养皿的背面该菌落处划上圆圈，并标记"Γ、"2"等数字，以便 识别；
[0173] (b)在无菌条件下，向试管中加入5mL LB液体培养基，然后再往其中加入5yL的 1000 X卡那霉素溶液，使其终浓度为50yg/mL。随后在试管上标记"Γ、"2"等数字；
[0174] (c)利用接种环，小心地将相应数字编号的菌落挑落进相应的试管中，混合均匀；
[0175] (d)将试管放入温控摇床，37°C、200rpm振荡培养16~24h;
[0176] (e) 16h后，观察试管中的LB液体培养基是否变混浊(若无菌生长就继续培养或者 重新转化），在无菌条件下，在两个洁净的EP管中分别加入500yL的菌液和500yL 60%的甘 油，混合均匀，并标记相应的数字，然后用封口膜将EP管封好，其中一管用于保留菌种之用， 另一管为测序做准备，将两个EP管都放入-80°C贮存，剩余的菌液放入4°C冰箱中保存备用；
[0177] (f)利用菌液PCR的方法进行检测。
[0178] 模板用lyL菌液代替，用上游引物EcoR I和下游引物Xho I进行PCR反应，再将PCR 反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，将阳性克隆菌株经鉴定后甘油保存，送公司进行测 序。
[0179] 6、重组质粒的中量制备
[0180] 使用Omega Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，制备重组质粒，步骤如下：
[0181] (a)挑取抗性平板上的重组菌落至50mL LB(含选择抗生素 Kan，终浓度为50yg/mL) 液体培养基中，200r/min、37°C培养过夜。（b)将1~5mL培养液12000r/min离心3min，弃上 清，收集菌体。（c)将菌体加入250yL冰预冷的裂解液I中，剧烈振荡，将细胞完全打散；（d)加 入250yL裂解液Π ，轻柔反复颠倒数次(切勿涡旋振荡）后，室温静置2min;(e)加入350yL裂 解液ΙΠ ，盖紧管口，立即颠倒数次，直至出现白色絮状沉淀；（f)微量离心机12000r/min、4°C 冷冻高速离心5min，上清液移至另一离心管中；（g)将离心管置入离心机，12000r/min、室温 离心10min;上清转入一支新管中；（h)将试剂盒中的Akibai in Column安置于Col lection Tube中；（i)将离心管中的上清液转移至Akibaiin Column中，注意别吸入沉淀，12000r/min 离心lmin，弃去滤液；（j)加入500yL HB Buffer至Akibaiin Column中，12000r/min离心 lmin，弃去滤液；（k)加入700yL的DNA Wash buffer，然后lOOOOrpm离心lmin，弃去滤液；（1) 重复加入700yL的DNA Wash buffer，然后lOOOOrpm离心lmin，弃去滤液；（m)再用12000rpm 离心2min以除尽剩余的Wash buffer; (η)将Akibai in Column放入一个洁净的EP管中，然后 在 Akibai in Column膜的中央处加入 30 ~50yL 的Elution Buffer，室温放置 2min，lOOOOrpm 离心lmin将重组质粒pET-28a-XYN-H31抽提下来。采用1 %琼脂糖凝胶电泳对质粒回收产物 进行检测。
[0182] 7、E.coli BL21Star(DE3)的转化
[0183] (a)将从重组E.coli T0P10F'中提取的质粒100yg与100yL感受态细胞混匀，冰浴 30min。42°C 水浴 90 秒，冰浴 2min。
[0184] (b)加入lmL LB培养基，混匀，37°C、180r/min温浴lh。
[0185] (c)3000r/min离心lmin，吸底部沉淀200yL至LB(含选择抗生素 Kan，终浓度为50μ g/mL)平板，用涂布器涂匀，37°C培养过夜。
[0186] 经过筛选后得到可以高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)_ XYN-H31。从E.coli BL21 Star(DE3)-XYN-H31菌株中提取质粒为模板，用上游引物EcoR I 和下游引物Xho I进行PCR反应，将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序 鉴定。测序结果表明重组质粒所携带的基因序列与目的基因的序列一模一样。可见，PET-28a-XYN-H31 重组质粒已经成功转入E.coli BL21 Star(DE3)〇
[0187] 8、重组大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)的诱导表达
[0188] (a)将筛选得到的阳性菌株E.coli BL21 Star(DE3)-XYN-H31接种到装有10mL LB 培养基的摇瓶中培养过夜。
[0189] (b)取过夜培养菌液100yL接种到装有50mL LB培养基的250mL摇瓶中培养。
[0190] (c)待0D值达到0.6时加入终浓度为ImM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行 诱导。
[0191] (d)于23°C诱导12小时后进行取样的。取lmL发酵液离心，去除上清液，加入100yL pH 6.0PBS缓冲液，重悬后液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后取上清 液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图12泳道2)。
[0192] 取lmL未经IPTG诱导的发酵液离心，去除上清液，加入100yL pH 6.0PBS缓冲液，重 悬后液氮反复冻融使细胞破碎，l〇〇〇〇r/min高速离心2min后取上清液，