有较好的序列耐 受性且可能适用于更长的多肽。
[0139] 图 16、图 17 为该多肽纯化后 HPLC(Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-15%，30min-40%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 结果，可找到对应分子量m/z = 1068. 5439 [M+H]。
[0140] 实施例6:
[0141] 末端甲基化L型酒石酸修饰多肽（cyclo-1,4)-[L_tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]_NH 2 的合成，即结构式（VID )的合成：
[0142]
[0143] 实施例1中手性二酸换为甲基化的L型酒石酸。实验步骤与实施例1相同，步骤 (5)直接可以得到产物，无需进行步骤(6)。经过高效液相色谱纯化可得到终产物，产物在 H20(25°C )中螺旋性提高，呈31Q螺旋（图18,表6)。
[0144] 表6多肽VID在25°C，H20中圆二色谱数据
[0145]
[0146] 多肽31(]螺旋是较α螺旋松散的一种螺旋结构，可用圆二色谱表征，其特征为 190nm处为正峰，同时218nm(长肽负峰位于222nm，短肽负峰会发生位移）、208nm为负峰且 θ 218/ Θ 2。8比例越接近〇. 5其螺旋含量越高，而上述结果说明末端侧链-尾链连接酒石酸结 合Dab修饰可以显著稳定多肽的二级结构，Dab由于比Dap多一个碳原子，使得稳定成为较 α螺旋松散的31(]螺旋结构。
[0147] 图 19、图 20 为该多肽纯化后 HPLC(Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm，乙腈 / 水：0min-2%，5min-10%，30min-30%)及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite) 结果，可找到对应分子量m/z = 544. 2735 [M+H]。
[0148] 实施例7 :
[0149] 末端 D 型天冬氨酸修饰长肽 SRC_lBox2PERM L-TCDa H-(cycl〇-2,5)_[ArgisoAsp IleLeuDapArg LeuLeuGln]_NH2 的合成，即结构式（IX )的合成：
[0150]
[0151] 实施例1中序列换为经改进的SRC-lBox2。实验步骤与实施例1相同，步骤（5)后 无需进行步骤(6)，而是修饰上一个精氨酸，此例证明了末端修饰的可变性。经过高效液相 色谱纯化可得到终产物，经稳定的多肽在H 20(25°C)中呈现特征的α螺旋（图21，表7)。
[0152] 表7多肽IX在25°C，H20中圆二色谱数据
[0153]
[0154] 多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征，其特征为190nm处为正峰，同时222nm、 208nm为负峰且θ 222/ Θ 2。8比例越接近1其螺旋含量越高，而上述结果说明末端侧链-尾 链连接天冬氨酸修饰可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构，并且该方法具有较好的序 列耐受性且可能适用于更长的多肽。在多肽上修饰FITC(SRC-lBox2PERML-T⑶bFIT C-(cyclo_3,6)-[i3AlaArgisoAspIle LeuDapArgLeuLeuGln]_NH2)，与 Hela 细胞孵育 (5yM，37°C，4hr，Leica CTR7000)发现该多肽具有良好的穿透细胞膜的能力，而相对应的 野生型的线性多肤（SRC_lBox2wtb FITC-PAlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln_NH2)不具 备穿膜能力。上述结果说明该方法可以赋予多肽穿透细胞膜的能力。
[0155] 图23、图24、图25、图26、图27、图28为所涉及多肽纯化后HPLC (Waters 600，Agilent Zorbax SB_Aq:4.6x 250mm,乙臆 / 水：0min_2%，5min_15%，30min_50% ) 及 HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果，可找到对应分子量 SRC-lBox2PERM L-TCDa : m/z = 547.3513[M+2H]， SRC-lBox2PERM L-TCDb :777.3887[M+2H]，SRC-lBox2wtb: 808. 9271 [M+2H]。图22为所涉及FITC修饰的所涉及多肽的细胞成像图。
[0156] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、 修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述 实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其结构式如式（I )所 示：其中，R为任意氨基酸残基，η为1~2的正整数，Ri、R2连接的碳原子至少一个为手性 碳原子，且Ri、R2各自独立地选自氨、烷基、氨基或其衍生物取代基和居基或其衍生物取代 基中的一种。2. 根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述手性二酸选自酒石酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和天冬氨酸或其衍生物 中的一种。3. 根据权利要求2所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述手性二酸为L型酒石酸或其衍生物。4. 根据权利要求2所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述手性二酸为手性中必位于N端目位的己醜化天冬氨酸或其衍生物。5. 根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述多肤的长度大于或等于5个氨基酸。6. 根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述R为L型氨基酸或者D型氨基酸。7. 根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述R为α氨基酸或目氨基酸。8. 根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物，其特 征在于，所述η为1。9. 根据权利要求1~8任一权利要求所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的 多肤化合物的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 固相合成末端含手性二酸，倒数第Η位含赖氨酸类似物的多肤，同时脱去駿基和氨基 保护基，关环得到含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物。10. 根据权利要求9所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物的合 成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)含有手性二酸的多肤的固相合成，固相合成得到的多肤化合物，其结构式如式 (II )所示：(2) 用铅催化剂同时脱去二酸保护基和氨基保护基； (3) 在六氣磯酸苯并Η哇-1-基-氧基Η化咯烷基磯/1-居基苯并Η哇条件下分子内 醜胺基关环，获得多肤； (4) 将步骤（3)所得的多肤从固相切下，经分离纯化获得含有末端侧链-尾链连接手性 二酸修饰的多肤化合物（I )，通过圆二色谱表征方法验证含有末端侧链-尾链连接手性二 酸修饰的多肤化合物的螺旋性； 其中，所述步骤（2)至步骤（3)的合成路线为：11.根据权利要求10所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物的合 成方法，其特征在于，当R2为巧甲氧撰醜保护的氨基时，需要脱除巧甲氧撰醜，然后保留氨 基，醜化或烷基化或连接生物素或连接英光基团，其合成路线为：12.根据权利要求9所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肤化合物的合 成方法在稳定多肤α-螺旋二级结构中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物及其合成方法，其结构式如式(Ⅰ)所示：本发明的多肽的合成方法包括如下步骤：(1)含有手性二酸的多肽的固相合成；(2)用钯催化剂同时脱去二酸保护基Allyl(烯丙基)和氨基保护基Alloc(烯丙氧羰基)；(3)在六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/1-羟基苯并三唑条件下分子内酰胺基关环，获得多肽；(4)将步骤(3)的多肽从固相切下，经分离纯化获得含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽，并通过圆二色谱等方法评价验证多肽的螺旋性，用荧光显微镜成像评价多肽的穿膜性。本发明的多肽及其合成方法成本低、简单高效，对于稳定多肽α-螺旋，提高其成药性有重要意义。
【IPC分类】C07K7/56, C07K1/04, C07K7/06, C07K1/06
【公开号】CN105566456
【申请号】CN201410528075
【发明人】李子刚, 赵辉
【申请人】北京大学深圳研究生院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月9日