中使用的也包含双链多核苷酸分子的常用DNA接头 分子。所述第二个DNA接头分子优选地包含具有修饰的骨架(例如硫代磷酸酯）的核苷酸。 [0074]优选地，所述第二个DNA接头分子是符合本发明的DNA接头分子(其中第一和反向 链的5'末端和第一链的3'末端如上所述进行修饰）。作为通用接头分子，所述第二个DNA接 头分子不必含有条形码，但优选地含有反向引物序列。有利的是，它也可以在步骤1之后添 加。
[0075]如果所述第二个DNA接头分子(或通用接头分子)是符合本发明的DNA接头分子，这 具有在进行连接之前不必失活酶、特别是末端修复酶的优点。
[0076]如果所述第二个DNA接头分子(或通用接头分子)是本领域已知的常用DNA接头分 子，则必须在连接（步骤4)之前进行末端修复酶的失活，这优选地通过在高温下温育来进 行，所述高温取决于所使用的酶，优选为超过60°C的温度。在这种情况下，所述第二个DNA接 头分子在失活之后，优选地与连接酶一起在连接混合物中添加。
[0077] 由于步骤1至3可以在另一个实验室中独立地进行，因此本发明还包括一种产生 DNA文库的方法，所述方法包括将符合本发明的DNA接头分子连接到片段化的、末端修复且 5'磷酸化的双链DNA的步骤，其中优选地在连接之前不进行酶、特别是末端修复酶的失活。
[0078] 所述连接是平末端连接，其优选地在本领域中公知的条件（例如在室温下2h或16 °C过夜）下进行。用于连接的优选的酶是T4 DNA连接酶。
[0079] 在如上所解释的连接步骤后，优选地通过添加缺口修复酶、优选为具有5'-3'核 酸外切酶活性和5 ' -3 '聚合酶活性的DNA依赖性DNA聚合酶进行缺口修复(步骤5)。所述缺 口修复酶优选为热稳定的，例如Taq聚合酶。通过优选地加热反应混合物，优选地到超过60 °C的温度，将连接酶失活并同时激活末端修复酶。用于步骤4和步骤5的酶可以作为含有缺 口修复酶和连接酶的混合物--"连接和缺口修复酶混合物"同时添加。有利情况下，"作为 连接缓冲剂"用于步骤4和步骤5的缓冲物质可以与"末端修复缓冲剂"中的相同，例如TRIS-HC1，并优选地具有7至8之间的pH。所述"连接缓冲剂"优选地还含有镁。为了进行缺口修复， 脱氧核苷三磷酸(优选为dATP、dTTP、dGTP和dCTP)也被添加到"连接缓冲剂"或分开添加。
[0080] 用于产生DNA文库的DNA优选为基因组DNA。基因组DNA文库的显著特点之一在于基 因组DNA文库基本上维持原始基因组(基因组DNA)上的一组基因或序列的拷贝数以及所述 基因组DNA上所述一组基因或序列的丰度比。
[0081] 本发明的另一个目的是用于产生DNA文库的试剂盒，其优选地用于执行上述产生 DNA文库的方法，所述试剂盒包含：
[0082] i .符合本发明的DNA接头分子，
[0083] ii .优选地，对于末端修复来说：具有3 ' -5 '核酸外切酶和5 ' -3 '聚合酶活性的 DNA聚合酶，以及脱氧核苷三磷酸(优选为dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，
[0084] i i i .优选地，对于5 '磷酸化来说:多核苷酸激酶，
[0085] iv.优选地，对于连接来说:连接酶，
[0086] v.优选地，如上所述的第二个DNA接头分子(优选为通用接头），
[0087] vi .优选地，对于缺口修复来说:具有5 ' -3 '核酸外切酶活性的聚合酶，以及 [0088] vi i .优选地，缓冲剂(如上所述，优选地包含镁和ATP)。
[0089]因此，所述试剂盒至少包含符合本发明的DNA接头分子，并且最优选地包含连接 酶。
[0090] 不同的酶优选地如上所述进行选择。
[0091] 组分ii和iii优选地被提供成如上所定义的"末端修复酶混合物"，优选地与如上 定义的"末端修复缓冲剂"一起或甚至与该缓冲剂混合。
[0092] 组分iv和v优选地被提供成"连接和缺口修复酶混合物"、"末端修复酶混合物"，优 选地与如上定义的"连接缓冲剂"一起或甚至与该缓冲剂混合。
[0093]如果未提供在缓冲剂中，所述试剂盒还可以含有作为"dNTP混合物"的脱氧核苷三 磷酸(优选为dATP、dTTP、dGTP和dCTP)作为分开的组分。
[0094]本发明的另一部分是上述DNA接头分子或上述试剂盒的用途，其用于产生DNA文 库，特别是用于下一代测序和/或文库复用领域中。符合本发明的DNA接头分子特别适合于 与自动化溶液一起使用，因为它们允许非常简单和稳健的流程。
[0095] 符合本发明的DNA接头修饰能够进行并促进文库复用，特别是在自动化流程中，这 是因为在文库制备开始时带有条形码的接头可能已被手动添加到DNA(在进行末端修复和 5'末端的磷酸化之前，添加到片段化的DNA)，并且随后可以在移液机器人上进行文库制备。 另一个有利特征在于末端修复酶的热失活不是必需的:末端修复的文库片段不被存在于末 端修复混合物中的酶进一步修饰，并且符合本发明的DNA接头分子也不是那些酶的底物。那 些酶在添加 DNA连接酶之前的连接前失活不是必需的，并且连接可以在有活性的末端修复 酶存在下进行。这允许极大缩短自动化文库制备流程，无需耗时的样品的加热和冷却。
[0096] 本发明通过下列附图和实施例进行进一步描述，但本发明不限于它们。
[0097] 图1示出了从现有技术状态已知的条形码接头，其被优化用于平末端连接，但是不 能在末端修复期间或之前添加(并且不能在没有进行末端修复酶的失活的情况下添加）。在 左侧示出了平末端连接位点。为了避免在3'位点上连接，第一链(SEQ ID No.9)具有3'突出 端，其包含硫代磷酸酯修饰的核苷A*C*(以避免所述突出端的降解）。互补的反向链(SEQ ID No. 10)较短。两条链的5'是未磷酸化的(具有游离的5'0H)，以减少接头二聚体的形成。条形 码序列被下划线。
[0098] 图2示出了符合本发明的条形码接头的实例。同样地在左侧示出了平末端连接位 点。为了避免在3 '位点上连接，将第一链(SEQ ID No. 11)用Ml修饰。将第一链的5 '用M2修饰 以避免磷酸化并减少接头二聚体和寡聚体的形成。将反向链(SEQ ID No. 12)的5'用M3修饰 以减少接头二聚体和寡聚体的形成。条形码序列被下划线。反向链的3'末端具有游离的3'-OH〇
[0099] 图3示出了符合本发明的修饰的条形码接头，其中第一链(SEQ ID No. 13)的5'-修 饰是5'-0MeT。为了产生平末端，反向链(SEQ ID No. 14)在3'末端具有互补的A，其具有游离 的3'-OH基团。
[0100] 图4示出了使用标准流程和使用未修饰和修饰的DNA接头分子的新的（或改良的） 文库制备流程产生的DNA文库的Ct值的比较，其中1A是参比。标识符1A至3E对应于表1(第一 列)之一。
[0101] 图5至11示出了在标准文库制备后(B)或在使用符合本发明的改良流程进行文库 制备后(A)，使用符合本发明的修饰的条形码接头（图6至11)或未修饰的条形码接头（图5) 的DNA文库的片段尺寸分析。DNA文库使用Agilent High Sensitivity Chip，在下限和上限 尺寸标志物(35-10380bp)之间的尺寸范围内定性。标识符1A至3E对应于表1之一。第一个峰 (40bp)对应于未结合的接头分子。图5Β和图6至11中的第二个峰对应于DNA文库。超过 10.000bp的峰对应于残留的未剪切的基因组DNA。在图5A中，多峰图案对应于接头寡聚体， 其在其它图中不存在。
[0102] 实施例1:在标准流程和改良的文库制备流程中不同修饰的DNA接头分子的比较
[0103] 为了试验DNA接头修饰的不同组合，合成了下列单链并在不同组合中应用：
[0104] 表1:
[0105]
[0106] 术语"/5SpC3/"是指本文中所定义的如上所述的5'-C3间隔基，所述5'-C3间隔基 是下式的1-羟基丙基-3-磷脂酰基终止物：
[0107]
[0108] 术语"/5dSp/"是指下式的作为5'_D间隔基的1，2_双脱氧核糖基-3-磷酸：
[0109]
[0110] 彳土斗、乂T/ JrtmMU/定指下式的作为3'-氨基修饰物的6-氨基己基-1-磷酸：
[0111]
[0112] 在本文中