Ξ氯乙酸水溶液= 40:60)的WK1菌株脂肤粗提物 高效液相色谱图。图8为流动相条件1(乙腊:0.05%Ξ氯乙酸水溶液= 40:60)的地衣芽抱杆 菌(Bacillus licheniformis)脂肤高效液相色谱图。地衣芽抱杆菌的脂肤可根据高效液相 色谱图的保留时间判断为Ξ类:0-12min是iturin类脂肤；15-25min是fengycin类脂肤;30- 35min是surfactin类脂肤。图7与图8对比可W表明WK1菌株的代谢物显然分布在fengycin 区域。
[0069] WK1菌株的代谢物成分非常复杂，绝大部分化合物没有被充分分离，因此其相应的 LC-MS图谱十分难W解析。因此，又进一步优化了 HPLC色谱条件，将流动相改为乙腊:0.05 % Ξ氯乙酸= 49:51(体积比），其他条件不变。同时对样品峰分别进行质谱分析，确定分子量。 由图9可W看出，WK1脂肤粗提物产率较高，且脂肤种类丰富，主要成分应为fengycins。而且 该粗提物在fengycin区域呈现差异丰富多样性峰处峰位置出现了比常见Bacillus菌株更 多的代谢物。
[0070] 几乎所有的Bacillus脂肤的分子量均大于900。然而该样品主要色谱峰的质谱图 给出的准分子离子峰均为700左右。运说明该类代谢物不同于iturin、fengycin、 sirfactin3类脂肤，或者形成了双离子峰。研究发现fengycin经常可W在ESI-MS质谱图上 产生双质子化的准分子离子峰。因此，所检测到的代谢物仍然极有可能是fengycins。
[0071 ]图10是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间12.78min的峰进行质谱分 析。假设m/z 725.26是双质子化离子[M+2H]2%则其分子量应为1448.5。运与fengycin类化 合物C15 fengycin A-致，因此12.78min处的色谱峰应为C15 fengycin A。
[0072] 图11是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间15.18min的峰进行质谱分 析。假设m/z 732.40是双离子峰[M+2H]h，则其分子量应为1462.8。运与常见fengycin类化 合物C16 fengycin A-致，因此15.18min处的色谱峰应为C16 fengycin A。
[0073] 图12是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间16.98min的峰进行质谱分 析。由双离子峰m/z 739.46[M+2H]2+可W推测出该化合物的分子量应为1476.9.与(：16 fengycin A相比多1姐a，即一个亚甲基单位(-C出-),说明该化合物的侧链长度应该多一个 亚甲基单位。即该化合物推测为C17 fengycin A.
[0074] 图13是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间18.64min的峰进行质谱分 析。18.64min处的色谱峰与16.98min处的色谱峰拥有相同的双电荷峰和分子量（1476.9)， 运说明该化合物应为前一个化合物的同分异构体。在fengyicin类脂肤中常见的异构化现 象发生在β-径基脂肪酸侧链的末端，Ξ种异构化形式分别为11〇^113^型(11-型），is〇-型W及 anteiso-型。因此，
[007引运两个化合物应为n-C17 fengycin A,is0-C17 fengycin A和anteis0-C17 fengycin A中的两种。
[0076]图14是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间19.59min的峰进行质谱分 析。由双离子峰m/z 746.43[M+2H]h可W推测出该化合物的分子量应为1490.8.比上一个化 合物又增加14化，说明其侧链再延长一个亚甲基单位。因此该化合物应为C18 fengycin A. [OOW]图15是对流动相条件2的高效液相色谱图中保留时间21.39min的峰分别质谱分 析。21.39min处给出与19.59min处色谱峰相同的准分子离子峰，说明它们同样是一对同分 异构体，异构化同样应发生在β-径基脂肪酸的末端。
[0078] WK1菌株发酵液的脂肤类化合物对多种病原真菌菌丝的抑制：
[0079] 采用滤纸片法，样品采用甲醇溶解，将20μ1样品加到灭好菌的滤纸片上挥去甲醇， 待测病原真菌挖块接种于固体培养基平板中央，周围放置不同浓度的加样品的滤纸片，于 28°C培养，测量抑菌圈，每个浓度Ξ个重复。W滤纸片中屯、为点，到菌丝边界画圆，用游标卡 尺测量Ξ个重复，取得平均值，即为抑菌圈直径。
[0080]表3 WK1菌株发酵液的脂肤类化合物对多种病原真菌菌丝的抑菌圈表 [0081 ](表 3)
[0082]
[0083]由表3可W看出，脂肤化合物抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎 病、立枯丝核菌、蔬菜根腐病、茄子辣椒根腐病运巧巾病原真菌的菌丝的生长。抑制效果在实 验范围内随浓度的增加而增强。
【主权项】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，其特征是该菌株的分类命名为解淀粉芽孢 杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefaciens subsp .plantarum)WKl，保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No. 11640，保藏日期为2015年11 月9日；该菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时，菌落直径为2.0~3.0mm、圆形、凸起、边缘 波状、表面褶皱粘稠、乳白色、不透明的菌落;革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽孢，芽 孢端生，椭圆形，芽孢囊膨大；营养肉汤液体静置培养，表面产生菌膜，液体浑浊;在质量比 为10%NaCl水溶液、pH=l~13条件中生长。2. -种对权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是应用该 菌株及其发酵液或灭菌发酵液上清液，抑制山核桃干腐病病原真菌的生长。3. 如权利要求2所述的对解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是所述的抑 制山核桃干腐病病原真菌生长的主要成分为脂肽类物质中的丰原素 fengycins，成分有 C15fengycin A、C16fengycin A、C17fengycin A、C18fengycin A及其异构体，异构体为侧 链的1101'1]^1-、丨80-和31^6丨80三种异构化形式。4. 一种权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，所述的菌株及其发酵 液和灭菌发酵液上清液的制备方法按如下步骤进行： (1) 活化菌种： 将保存在斜面培养基中的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株，在NA固体培养基上划线 生长48小时； (2) WK1菌株发酵液的制备： 选取NA固体培养基上的单菌落，接种于100ml NA液体培养基中，在37 °C、180r/min条件 下培养14小时，得到种子液;再将种子液按接种量为3% (v/v)分别接种于500ml ΝΑ液体培 养基中，在37 °C、180r/min条件下培养48小时，得到概1菌株发酵液； (3) WK1灭菌发酵液上清液的制备： 将步骤(2)所述菌体的WK1菌株发酵液于高温高压灭菌锅里121°C灭菌30min后，将灭菌 发酵液3000r/min离心15min后，得概1灭菌发酵液上清液。5. 如权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种WK1菌株的应用，其特征是所述的脂肽 类物质具有抑制杉木枯萎病、棉花黄病、哈密瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、立枯丝核菌、蔬菜根腐 病、前子辣椒根腐病病原菌菌丝生长的作用。
【专利摘要】一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种<i>Bacillus？amyloliquefaciens？subsp.plantarum？</i>WK1菌株，从土壤中分离纯化获得，在CGMCC保藏，保藏编号为？：CGMCC？No.11640，保藏起始日期为2015年11月9日。该菌株的菌体、活性发酵液、灭菌发酵液、及发酵液提取的脂肽类物质均可用于山核桃干腐病病原菌<i>Botryosphaeria？dothidea</i>的生物防治。脂肽类中fengycins占绝对优势、且成分多样而丰富，通过LC-MS对fengycins类脂肽分析得知，分别为C15？fengycin？A、C16？fengycin？A、C17？fengycin？A、C18？fengycin？A及其异构体等成分。该菌株脂肽类物质还具有广谱拮抗活性，能抑制多种病原真菌菌丝生长。该菌种是开发环境友好型生物农药的潜在资源，具有重要的应用前景。CGMCC No.1164020151109
【IPC分类】A01N63/02, C12R1/07, A01P3/00, C12N1/20
【公开号】CN105586297
【申请号】CN201610071330
【发明人】徐秋芳, 程敏
【申请人】浙江农林大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年2月1日