标志物M/Z :2381进 行鉴定，采用Waters公司Nano Acquity UPLC对经磁珠分离收集的质谱上样剩余的血清蛋 白多肽进行二维凝胶色谱分离，收集15~30份肽段馏份:在收集液中检测到目的蛋白；再联 用Thermo Fisher公司LTQ Orbitrap XL质谱系统对孤独症患儿血清中表达上调的蛋白多 肽M/Z: 2381进行序列鉴定。
[0044] 具体的操作步骤为：
[0045] 3.1样本前处理
[0046]合并提取后的蛋白样，1300转，10分钟，取上清液，冷冻干燥仪干燥，使终体积在 50ul，得到液体A，用安捷伦ziptip萃取柱，浓缩处理液体A。处理方法：① ziptip柱子用 100 %乙腈吹打5次，活化柱子;②活化好的ziptip在液体1中，反复吹吸10次，尽量避免气泡 产生;③50%ACN 0 · 1 %TFA水溶液，洗涤3次ziptip柱子;④、ziptip柱子在0 · 1 %TFA中反复 吹吸，使样本洗脱，得到洗脱液2;⑤重复以上1-4步，30次;⑥合并30次的洗脱液2，冷冻干燥 至10ul，用于质谱鉴定。
[0047] 3.2色谱分离：
[0048]原始样品加10ul流动相A，转移至进样瓶中，共20ul。
[0049] 一维超高效液相系统：Waters公司Nano Aquity UPLC(Waters Corporation, 1^1【(^(1，1]5八)。色谱柱：
[0050] 捕集柱：Symmeiry⑧C18，5μηι，180μηιΧ 20mm，nanoAcquity?Column [0051 ]分析柱：Symnietry?C18,3.5ym，75ymX 150mm，nanoAcquity?Column
[0052] 流动相A: 5%乙腈，0.1 %甲酸的水溶液
[0053] 流动相B: 95%乙腈，0.1 %甲酸的水溶液;所有溶液均为HPLC级。
[0054] 捕集流速15μ1/η?η，捕集时间3min，分析流速400nl/min;分析时间60min，色谱柱 温度35°C ;Partial Loop模式进样，进样体积18μ1。
[0055] 梯度洗脱程序：
[0056]
[0058] 凝胶色谱分离结果如图3所示。色谱图中横坐标表示样本流出时间，纵坐标代表多 肽相对丰度，色谱设定时间为60min，从10min开始收集收集馏分，多肽成分主要在15min后 被分离并采用梯度洗脱方式，使洗脱效率提高，设定捕集时间收集馏分:收集15~30份肽段 馏份。
[0059] 3.3LTQ-〇rbitrap XL质谱分析：
[0060]使用Thermo Fisher公司LTQ Obitrap XL质谱分析系统。Nano离子源（Michrom Bioresources，Auburn，USA)，喷雾电压1.8kV;质谱扫描时间60min;实验模式为数据依赖 (Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion)，在10秒内对母离子进行2次串级之后 加入到排除列表内90秒;扫描范围400-2000m/z; -级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为 100000 ;CID及二级扫描使用LTQ;在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为 母离子进行MS/MS(单电荷排除，不作为母离子）。检测结果如图3所示。
[0061 ] 数据分析:使用数据分析软件Bioworks Browser 3.3.1SP1进行Sequest?检索。母 离子误差设定为lOOppm，碎片离子误差设为IDa，酶切方式为非酶切，可变修饰为Μ (Methionine)甲硫氨酸氧化。检索结果参数设定为deltacn> = 0.10。检索结果为:m/z : 2381.05; IPI: IPI00010290.2;Gene Symbol =FABP1 protein (Fragment);序列为 K.SVTELNGDIITNTMTLGDIVFK.R。所分离的]\1/2:2381称为?48?14，为人肝型脂肪酸结合蛋白 l(FABPl)的一个片段，其精确分子量为2381道尔顿，其氨基酸序列 K· SVTELNGDIITNTMTLGDIVFK·R(如SEQ· ID·N0· 1 所示）。
[0062]因此，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI -T0F-MS)检测FABP1-A或 ELISA方法测检测FABP1的表达水平，可作为孤独症患儿检测的方法。
[0063] FABP1-A作为FABP1的一个片段，提示FABP1是与孤独症特异性相关的蛋白，进一步 通过ELISA检测来进行验证。
[0064] 4、孤独症血清FABP1表达的ELISA血清验证分析：
[0065] 1)血清样本:收集孤独症患儿血清48例（男性40例，女性8例；平均年龄3.5岁）、正 常对照儿童血清40例（男性35例；女性5例；平均年龄3.5岁）进行ELISA的血清验证分析。所 有血清样本均来自西安交通大学附属儿童医院，采集时间2014年1月~2015年12月。
[0066] 2)检测方法：采用酶联免疫法（ELISA)检测孤独症患儿以及正常对照组的血清 FABP1的表达水平，试剂盒购自美国R&D公司。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附 试验(ELISA):往预先包被抗人的FABP1蛋白（FABP1)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标 准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化 下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的FABP1蛋白呈正 相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值），计算样品浓度。具体实验步骤参照试剂 盒说明书，阳性判定标准按照试剂盒说明书界定。
[0067] 3)统计方法:采用6抑口1^(1.?1^111.￥5.01软件进行单因素方差分析(4勵\^)以及 独立样本的T检验。
[0068] 4)结果分析:酶联免疫法分析结果表明FABP1在孤独症及正常对照检测组中的表 达水平为孤独症￥8正常对照组:0.84±0.12(0.65~1.25>80.54±0.08(0.37~0.59)，口〈 0.001，组间具有显著性差异，具体结果如图4所示。
[0069] 对正常对照人群以及孤独症患儿血清中的FABP1进行ELISA检测，结果表明孤独症 患儿血清中FABP1显著高表达(孤独症vs正常对照组:0.84±0.12vs 0.54±0.08):在正常 对照儿童血清中表达范围为:0.37~0.59ng/mL;在孤独症患儿血清中表达范围为:0.65~ 1.25ng/mL，且组间具有极显著差异(p〈0.001)。这表明：FABP1是与孤独症发生密切相关的 蛋白，且在对照组与孤独症组的表达范围并无交集存在，可以作为初步的孤独症检测指标。 [0070]因此可以通过ELISA实验对待检血清样本的FABP1表达初步判定其是否还有孤独 症：孤独症患儿（Ο · 65~1 · 25ng/mL);正常人群（Ο · 37~Ο · 59ng/mL)。
[0071]综上所述，本发明公开了一种孤独症血清多肽标志物及其应用。其氨基酸序列如 SEQ. ID. NO. 1所示。该分子称为FABP1-A，是人肝型脂肪酸结合蛋白1 (FABP1)的一个片段，其 精确分子量为2381道尔顿。FABP1-A在孤独症患儿血清检测中呈现特异性的高表达，用基质 辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-T0F-MS)检测FABP1-A或ELISA方法测检测FABP1 的表达水平，可作为孤独症血清的检测方法。
【主权项】
1. 一种孤独症血清多肽标志物FABP1-A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所 不。2. 如权利要求1所述的孤独症血清多肽标志物FABP1 -A，其特征在于，该多肽标志物 FABP1-A为人肝型脂肪酸结合蛋白FABP1的一个片段，分子量为2381道尔顿。3. 如权利要求1所述的孤独症血清多肽标志物FABP1-A，其特征在于，其血清中的检测 参数为 0.65~1.25ng/mL。4. 权利要求1所述的孤独症血清多肽标志物FABP 1-A作为孤独症血清诊断药物的靶点 的应用。5. 权利要求1所述的孤独症血清多肽标志物FABP 1-A在制备孤独症血清诊断药物中的 应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述孤独症血清诊断药物为ELISA检测孤独 症血清多肽分子的药物。7. 与权利要求1所述的孤独症血清多肽标志物FABP1-A相结合的分子在制备孤独症血 清诊断药物中的应用。 8 .FABP1蛋白作为孤独症血清诊断药物的靶点的应用。9.与FABP1蛋白相结合的分子在制备孤独症血清诊断药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种孤独症血清多肽标志物及其应用。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该分子称为FABP1-A，是人肝型脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的一个片段，其精确分子量为2381道尔顿。FABP1-A在孤独症患儿血清检测中呈现特异性的高表达，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)检测FABP1-A或ELISA方法测检测FABP1的表达水平，可作为孤独症血清的检测方法。
【IPC分类】C07K14/47, G01N33/68
【公开号】CN105622742
【申请号】CN201610095160
【发明人】杨娟, 黄辰, 宋土生, 陈艳妮
【申请人】西安交通大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月22日