天然黄酮Anastatin B的衍生物及制备和应用
【专利摘要】本发明属于新化合物制备和药物领域，涉及天然黄酮Anastatin B的衍生物及制备和应用，具体是两个黄酮的衍生物制备及其在制备抗氧化和抗肝损伤药物中的应用，结构式如下。本发明首次合成出天然黄酮Anastatin B的两个衍生物，并首次利用体外化学评价法和细胞氧化损伤模型评价了化合物1和2的抗氧化活性，并运用CCl4诱导的小鼠肝损伤模型评价这两个化合物的保肝活性。
【技术领域】
[0001]本发明属于新化合物制备方法及药物领域，尤其是天然黄酮Anastatin B的两个 衍生物的制备及其在制备抗氧化和抗肝损伤药物中的应用。 天然黄酮Anastat i n B的衍生物及制备和应用
【背景技术】
[0002] Anastatin B是含生草(Anastatica hierochuntica)中提取得到的一种黄酮类化 合物，有报道显示Anastatin B衍生物具有良好的抗氧化活性，并对大鼠的原代肝细胞损伤 具有一定保护作用，有一定程度的对抗D-GalN诱导损伤的能力，在抗肝损伤药物研究领域 也有应用。
[0003] 由于Anastatin B本身具有良好的生物活性，所以可通过研究Anastatin B的衍生 物来寻找更好的抗氧化和抗肝损伤药物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供两个黄酮的衍生物制备及其在制备抗氧化和抗肝损伤药 物中的应用，本发明合成出天然黄酮Anastatin B的两个衍生物1和2,这两个衍生物具有较 好的抗氧化活性及抗肝损伤活性，合成和纯化方法简单。
[0005] 本发明所述Anastatin B的两个衍生物1和2具有抗氧化活性，可以用于抗氧化治 疗，可应用于制备抗氧化药物;所述天然黄酮Anastatin B的两个衍生物1和2具有抗肝损伤 活性，可应用于制备抗肝损伤药物。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现的：
[0007] Anastatin B衍生物的结构式如下：
[0008]
[0009] 而且，所述衍生物为4，8，9-三羟基-2-(4-羟基苄基)-2H-苯并呋喃并[2，3-g]苯并 呋喃-3-酮，（Z)-4,8,9-三羟基-2-(4-羟基亚苄基）-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮。
[00?0] Anastatin B两个衍生物的制备。
[0011]
[0012] 两个衍生物在制备治疗抗氧化和抗肝损伤药物中的应用。所述化合物对抗氧化活 性进行评价，结果表明此类化合物有抗氧化活性，同时所述化合物对保肝活性进行评价，结 果表明此类化合物有抗肝损伤活性。
[0013] 两个衍生物在制备治疗抗氧化和抗肝损伤药物中的应用。所述化合物用作制备治 疗肝损伤药物和抗氧化药物。
[0014] 本发明的优点和积极效果：
[0015] 1、本发明合所述的Anastatin B的两个衍生物1和2的合成、纯化方法简单。这类衍 生物具有抗氧化和抗肝损伤活性，本发明开拓了一类新型抗氧化和抗肝损伤药物的研究方 向。
[0016] 2、所述的Anastatin B的两个衍生物1和2的制备及其在制备抗氧化和抗肝损伤药 物中的应用，其特征在于:所述化合物对抗氧化活性进行评价，结果表明此类化合物有抗氧 化活性，同时所述化合物对保肝活性进行评价，结果表明此类化合物有抗肝损伤活性。 [0017] 3、所述的Anastatin B的两个衍生物1和2的制备及其在制备抗氧化和抗肝损伤药 物中的应用，其特征在于:所述化合物用作制备治疗肝损伤药物和抗氧化药物。
【附图说明】
[0018] 图1为compound 1的PC-12氧化损伤模型抗氧化活性测试结果；
[0019] 图2为compound 2的PC-12氧化损伤模型抗氧化活性测试结果；
[0020] 图3为化合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤血衆AST的影响；
[0021 ]图4为化合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤血衆ALT的影响；
[0022] 图5为化合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤血浆LDH的影响；
[0023] 图6为化合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤血清MDA的影响；
[0024] 图7为化合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤血衆GSH的影响；
[0025]图8为4,8,9_三羟基-2-(4-羟基苄基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮的 核磁共振氢谱；
[0026] 图9为(Z)-4,8,9-三羟基-2-(4-羟基亚苄基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃- 3-酮的核磁共振氢谱。
【具体实施方式】
[0027]为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0028] 本发明基于Anastatin B有很好的生物活性，首次合成出Anastatin B的两个衍生 物1和2,这类衍生物具有较好的抗氧化活性及抗肝损伤活性。其总还原能力、DPPH ·自由基 清除能力和ABTS ·自由基清除均与Vc相当，且均具有良好的细胞水平抗氧化损伤活性；同 时整体水平上对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤体现出良好的保护作用，有效抑制了肝损伤指 标ASL、ALT、LDH和MDA的活性及含量;提升了动物体内重要的保护酶GSH含量。
[0029]⑴利用体外化学法评价了 1和2的总还原能力、ABTS ·自由基清除能力及DPPH ·自 由基清除能力。实验结果显示：1和2的总还原能力分别为221 · 56g/mol和193 · 66g/mol; ABTS ·自由基清除力的EC5q值分别为2.40mM和2.74mM;DPPH ·自由基清除力的Ec5q值分别 为0.13mM和0.16mM。以上结果说明：1和2都具有良好的体外抗氧化活性和清除自由基的能 力。
[0030] ⑵进一步在细胞水平上验证了 1和2的细胞毒性及对H2O2诱导PC-12细胞氧化损伤 的保护作用。实验结果显示:单独使用1〇〇μΜ的1或2处理PC-12细胞48h后，细胞的存活率分 别为31.96%和60.77%，说明2的细胞毒性较小；当使用ΙμΜ的化合物对PC-12细胞进行预保 护时，2处理组能有效的抑制H 2O2诱导的PC-12细胞氧化损伤，细胞存活率为93.75%，是1处 理组细胞存活率(35.77% )的2.6倍。以上结果说明：与1相比较，2的细胞毒性更低，对H2O2诱 导PC-12细胞氧化损伤的保护作用更强。
[0031] ⑶利用四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤模型评价了 1和2的保肝活性。实验 结果显示:与CCl4模型组相比，1预处理组和2预处理组的肝损伤指标如ALT、AST、LDH、MDA的 活性和含量明显降低，而对肝损伤起保护作用的GSH含量显著升高，且2预处理组的保护效 果效果优于I (p〈〇. 01)。
[0032]⑷Anastatin B的衍生物1和2合成、纯化方法简单并具有较好的抗氧化及保肝活 性，在抗氧化和抗肝损伤药物的开发与应用方面具有广阔的前景。
[0033]本发明所涉及的化合物在抗氧化及抗肝损伤药物中的应用，包括但不限于在治疗 肝损伤药物中的应用。
[0034]本发明提供化合物1和2 LjrsLJ,、
[0035]
[0036] 本发明特别包括化合物：
[0037] (1 )4，8，9-三羟基-2-(4-羟基苄基)-2H-苯并呋喃并[2，3-g]苯并呋喃-3-酮
[0038] (2)(2)-4,8,9-三羟基-2-(4-羟基亚苄基)-2!1-苯并呋喃并[2,31]苯并呋喃-3-酮
[0039] 化合物1和2的合成路线
[0040]
[0041] 说明 1
[0042] (Z)-4,8,9-三羟基-2-(4-羟基亚苄基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮
[0043] 取(Z)-7-溴-4,6-二异丙氧基-2-(4-异丙氧基亚苄基)苯并呋喃-3(2H)_酮4.76g (lO.Ommol)，3,4_亚甲基苯棚酸1.83g(ll .Ommol)，Pd(PPh3)4l · 16g(l .Ommol)，Cs2C〇36.53g (20mmoI)，放入50mL支口反应瓶中，加入20mL N，N-二甲基甲酰胺，氩气保护下，加热到100 °C下反应12小时。TLC检测反应完全后，将反应液冷却至室温，然后倒入200mL冰水中，用二 氯甲烷萃取（3X50mL)，合并有机相，经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，用展开剂石油 醚 ：乙酸乙酯=30:1，200-300目硅胶柱层析纯化，得(2)-7-(苯并[(1][1，3]二氧杂环戊烯- 5-基)-4,6-二异丙氧基-2-(4-异丙氧基亚苄基)苯并呋喃-3(2H)_酮3.88g，产率75%。
[0044] 取(Z)-7-(苯并[d][1， 3]二氧杂环戊烯-5-基)-4,6_二异丙氧基-2- (4-异丙氧基 亚苄基)苯并呋喃-3(2H)_酮5.17g(10.0mmol)，放入200mL圆底烧瓶中，加入20mL无水二氯 甲烷，冰浴搅拌下，缓慢滴加70mL三氯化硼溶液(70.0 mmoI，lmo 1/L的二氯甲烷溶液），滴加 完成后，将反应液加热到40°C冷凝回流4小时。TLC检测反应完全后，将反应溶液冷却至室 温，再将反应液慢慢倒入IOOmL冰水中，搅拌10分钟，抽滤，并用水洗涤滤饼，再将滤饼干燥 后，得到（Z)-7-(3,4-二羟基苯基）-4,6_二羟基-2-(4-羟基亚苄基）苯并呋喃-3(2H)_酮 3.74g，产率 99%。
[0045] 取(Z)-7-(3，4_二羟基苯基)-4,6-二羟基-2-(4-羟基亚苄基)苯并呋喃-3(2H)_酮 378mg(lmmol)放入25mL圆底烧瓶中，加入IOmL N，N-二甲基甲酰胺，搅拌下加入Ag2〇 463mg (2mmol)，50°C加热反应4小时。TLC检测反应完全后，将反应溶液冷却至室温，再向反应溶液 中加入5mL无水甲醇，搅拌30分钟。用硅藻土过滤掉反应液中的固体，并用乙酸乙酯洗涤，收 集反应液，将反应液倒入100mL水中，用乙酸乙酯萃取(3X IOOmL)，合并有机相，经饱和食盐 水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干后，得到（Z)-4,8,9-三羟基-2-(4-羟基亚苄基)-2H-苯 并呋喃并[2，3-g]苯并呋喃-3-酮282mg，产率75%。
[0046] 4^^(4001^,01^0)311.18(8,111),10.25(8,111),9.48(8,111),9.44(8,1!!), 7.92(d，J = 8.4Hz，2H)，7.40(s，lH)，7.08(s，lH)，7.00(d，J = 8.0Hz，2H)，6.79(s，lH)，6.76 (s，lH)〇
[0047] 说明 2
[0048] 4,8,9_三羟基-2-(4-羟基苄基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮 [0049] 取(Z)-4,8,9-三羟基-2-(4-羟基亚苄基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮 376mg(lmmol)，IOmL圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇，搅拌下加入Pd/C(10% )40mg，用氢气球 提供氢气和压力，室温下搅拌12小时。用硅藻土过滤掉反应液中的固体，并用无水乙醇洗 涤，收集反应液，减压蒸干后，得到4，8，9-三羟基-2-(4-羟基苄基)-2H-苯并呋喃并[2，3-g] 苯并呋喃-3-酮370mg，产率98%。
[0050] 1H NMR(400MHz，DMS0)S10.88(s，1H)，9.32(s，1H)，9.23(s，1H)，9.20(s，1H)，7.11 (m,3H),7.01(s,lH) ,6.66(d ,J = 8.4Hz , 2H), 6.54(s, 1H), 5.04(m, 1H), 3.18(dd J= 14.8, 3.6Hz,lH),2.91(dd ,J = 14.8,8.0Hz,lH).
[0051 ] 实施例1
[0052]体外化学法评价了 I和2的总还原能力、ABTS ·自由基清除能力及DPPH ·自由基清 除能力测试。根据常规实验方法检测1和2的总还原能力、ABTS ·自由基清除能力及DPPH · 自由基清除能力，结果如表1所示。 「00531 丟1 ik会物优孙水平的碰究 LUUDDJ 头施觀
[0056] Compound 1和2对PC-12细胞氧化损伤的保护作用研究
[0057]细胞培养使用的培养液为含1 %的青霉素-链霉素溶液，10 %的胎牛血清的PRMI 1640细胞培养液，培养条件为37°C、含5%C02的恒温培养箱。根据实验PC-12细胞氧化损伤 模型实验条件，对3个化合物进行抗氧化测试。根据化合物溶解度及细胞活性测试常用浓 度，用DMSO作为溶剂将化合物稀释为不同浓度梯度，在实验体系中，同时设置加入待测化合 后加入H 2O2组和H2O组作为对照组，加入H2O组用作测试化合物对PC-12细胞的细胞毒作用。 根据构建的氧化应激模型，对compound 1和compound 2的细胞水平氧化损伤保护作用进行 了测试，进行三次平行实验，其实验结果见图1和图2。
[0058] 实施例3
[0059] Compound 1和2对小鼠急性肝损伤的保护作用研究
[0060] (1)分组与给药
[0061] 对72只小鼠（雌)进行平均随机分成9组，每组8只，分别为空白组、模型组、联苯双 酯滴丸组、compound 1高剂量组、compound 1中剂量组、compound 1低剂量组、compound 2 高剂量组、compound 2中剂量组、compound 2低剂量组。
[0062] 本实验给药方式为灌胃给药，在第一次给药前禁食12小时，自由饮水。称量后按照 下表对各组小鼠进行给药。
[0063] 表2小鼠给药剂量
[0066] (2)造模与取样
[0067]从第一次给药开始，每天给药1次，连续给药10天。第十天给药1小时后，对非空白 组小鼠腹腔注射〇.3mL 0.25%四氯化碳花生油进行染毒，对空白组小鼠腹腔注射0.3mL普 通花生油进行染毒。
[0068] 染毒20h后对所有小鼠取血，放置于肝素钠 EP管中，然后在4 °C 3000r/min离心10分 钟后，吸取上层血清置于冰上待用。
[0069] 对每只小鼠取出0.1-0.2g肝脏。用移液枪吸取9倍肝脏样本重量的0.86%预冷生 理盐水，取其2/3加入玻璃匀浆器中。将肝脏样本剪碎后倒入玻璃匀浆器中，将剩余的1/3预 冷的0.86%生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中。一手握住匀浆管 下端插入冰上，另一手将捣杆竖直插入套管中，上下转动研磨6-8分钟确保肝脏组织被充分 研碎，使组织匀浆化。在4°C3000r/min离心10分钟后，吸取上层清液待用。
[0070] (3)AST/ALT/LDH/MDA/GSH 检测试剂盒
[0071] 按照试剂盒说明书测定AST/ALT/LDH/MDA/GSH的含量及活性。结果如图3-图7所 不。
【主权项】
1. 天然黄酮Anastatin B的衍生物，其特征在于:衍生物的结构如下：2. -种制备权利要求1所述的天然黄酮A n a s t a t i η B的衍生物的方法，其特征在于：制 备方法如下：3. 天然黄酮Anastatin Β的衍生物，其特征在于:衍生物的结构如下：4. 一种制备权利要求3所述的天然黄酮Anastatin B的衍生物的方法，其特征在于：制 备方法如下：5.根据权利要求1或3所述的Anastatin B的衍生物在制备治疗抗氧化和抗肝损伤药物 中的应用。
【文档编号】A61P39/06GK105859737SQ201610325752
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】郁彭, 徐传明, 潘国军, 滕玉鸥, 向岑, 杨珂, 马艳涛, 李旭哲, 陈明朗, 沈棣, 苏超, 芦逵
【申请人】天津科技大学