一种新的吲哚生物碱类化合物及其制备方法和医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种新的吲哚生物碱类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的吲哚生物碱类化合物，可以从延胡索的干燥块根中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够抑制肾癌细胞株RC?2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性，可以用来开发成治疗肾癌的药物。
【专利说明】
一种新的吲哚生物碱类化合物及其制备方法和医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从延胡索的干燥块根中分离得到的一种具有 治疗肾癌作用的吲哚生物碱类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 延胡索为罂粟科植物延胡索W. T. Wang的干燥块莖，是一 味古老的止痛良药，又称玄胡、元胡，为著名的浙八味之一，主产浙江省东阳、磐安一带。延 胡索具有显著的镇痛、镇静和催眠作用，对冠心病、心律失常、胃溃疡等多种疾病有较好的 临床效果。正因为延胡索效果显著，临床应用广泛，在《中国药典》2010年版中，接近30%的复 方制剂中使用了延胡索。
[0003] 延胡索主要成分为生物碱，主要为叔胺、季胺类生物碱。叔胺类生物碱在原药材中 的量约为0.65%，季铵类生物碱(如延胡索甲素、乙素）约为0.3%。到目前为止，从延胡索中分 离得到的生物碱类成分约有30种。从延胡索的块茎中共提出生物碱10余种，其中经鉴定的 有紫堇碱（〇0^(^1；[116)、(11-四氢掌叶防己碱（(11-161^3117(11'(^3111^1：；[116)、原阿片碱 (Protopine )、L-四氢黄连碱、dl-四氢黄连碱、L-四氢非洲防己碱、紫堇鳞茎碱 (00^1311113；[116)、0-高白屈菜碱（0-!101]1〇(3116-1丨(1〇11；[116)、黄连碱（&^1：丨8；[116)、去氢紫堇碱 (De-hydrocorydaline)，还有紫堇达明碱(Corydalmine即紫堇鳞莖碱）、去氢紫堇达明碱 等。除生物碱外，延胡索中尚含有大量淀粉，少量黏液质、树脂、挥发油，另含无机微量元素。 还含有多糖、羟链霉素(reticulin)、豆甾醇、谷甾醇、油酸、亚油酸、亚麻酸、延胡索酸、10-二十九碳醇等。
[0004] 延胡索中的生物碱具有很强的镇痛、镇静、降压和抗心律失常作用。目前，很多新 的研究表明，延胡索还具有其他广泛的生理活性，如抗心肌缺血、抗实验性胃溃疡、抗肿瘤、 抗氧化、保肝等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从延胡索的干燥块根中分离得到的一种具有治疗肾癌 作用的吲哚生物碱类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 具有下述结构式的化合物（I)，
[0007] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)延胡索的干燥块根粉碎，用 80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱12个柱体积， 收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱物浸膏用 正相硅胶分离，依次用体积比为85 :1、55:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和10:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶分离，用体积百分浓度为80%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱 液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0008] 进一步地，步骤(a)中，用85%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0009] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0010] -种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I)和 药学上可接受的载体。
[0011] 所述的化合物(I)在制备治疗肾癌的药物中的应用。
[0012] 所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
[0013] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0014] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0015] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0017] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试 剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0018] 制备方法：（a)将延胡索的干燥块根（5kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取（25L X 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L X 3次）、乙酸乙酯(3L X 3次)和水饱 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再 用75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（131g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积）、55:1 (8个柱体积）、35:1 (6个柱体积）、15:1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(29g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 20:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和10:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(llg)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为80%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (I)(278mg)〇
[0019] 结构确证:黄色油状物，册43頂3显示[1+!1]+为111/2 337.1863，结合核磁特征可得 分子式为C21H24N2〇2，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δ Η(ΡΡπι，CDC13，500MHz) :H-3(4.03， m),H-5(3.47,d,/=6.9Hz),H-6a(3.38,dd,/=16.1,6.9Hz),H-6b(2.63,d,/=16.1Ηz),Η-9 (7.49，dJ=8.2Hz)，H-10(7· 13，tdJ=8.2，l ·3Ηζ)，Η-11(7·23，?(1，/=8·2，1·3Ηζ)，Η-12 (7.31,d,/=8.2Hz),H-14a(2.73,d,/=13.2Hz),H-14b(1.82,d,/=13.2Hz),H-17a(4.34,d,/ =12.8Hz),H-17b(4.21,d,/=12.8Hz),H-18(2.14,s),H-20(2.86,d,/=3.1Hz),H-21a(3.74, (Μ，/=12·4,3·1Ηz)，Η-21?3(4·06，(1，/=12·4Ηζ)，Νι-Μ θ(3·66,8)，Ν4-Μθ(2·28,8);核磁共振碳 谱数据3。（口口111，〇0(：13，1251!^) :134.8((：，2-〇,53.7(〇1，3-〇,63.4((：!1，5-〇,23.9(〇12,6-C)，107.7(C，7-C)，128.6(C，8-C)，119.8(CH，9-C)，120.7(CH，10-C)，122.9(CH，n-C)， 109.4(CH，12-C)，132.1(C，13-C)，32.9(CH2，14-C)，126.8(C，15-C)，131.3(C，16-C)，64.5 (CH2，17-C)，28.6(CH 3，18-C)，207.4(C，19-C)，50.2(CH，20-C)，66.7(CH2,21-C)，29.3(CH 3， Ni-MehAUdA-Me)。红外波谱中在1720CHT1尖锐吸收峰是由该化合物中的羰基产生； 且UV谱图表明在228nm与286nm有紫外吸收，显示该化合物含有吲哚发色基团。 1H-NMR谱显 示一组无取代吲哚片段的质子信号 <8-9 7.49(lH，dJ=8.2Hz)、<8-?ο 7.13(lH，tdJ=8.2， 1·3Ηζ)、丨11 7.23(1!1汀(1，/=8.2，1.3抱）与丨12 7.31(1!1，(1，/=8.2抱）；两个1013质子信号<? !13.66(3!1，8，沁-]\^)与2.28(3H，s，N4_Me) ;两组移向低场的连氧亚甲基质子信号(g-17a4.34 (lH，d，/=12·8Ηζ)与 <8-m4.21(lH，d，/=12·8Ηζ)以及 <8-21a3.74(lH，ddJ=12.4,3.1Hz)与 <8-2ib4.06(lH，d，7=12·4Ηζ) ;两组亚甲基质子信号 <8-6a 3.38(lH，ddJ=16.1，6.9Hz)与 兩-乩2.63(1!1，(1，7=16.1取）以及（8- 1432.73(1!1，(1，7=13.2泡）与（8-1仙1.82(1!1，(1，7= 13.2Hz )。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有21个碳信号，包括三个甲基，四个亚甲基，七个次 甲基，以及七个季碳；以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为五环结构。13C-NMR谱与 DEPT谱显示该化合物中存在甲基酮结构片段f19 207.4(C)与f18 28.6(CH3)，吲哚结构片 段 2 134.8(C)、7 107.7(C)、8 128.6(C)、9 119.8(00、?ο 120.7(00、11 122.9(00、12 109.4(CH)与 13 132.1(C)，两个N-甲基信号 C30.4(CH3，Ni-Me)与 C39.4(CH3，N4_Me)。另COSY与HSQC波谱数据揭示该化合物中含有-NCHCH2-结构片段(-N4-C5-C 6-与-N4-C3-C14-)。进一步分析 HMBC 谱，H-14a/H-14b 与 C-15/C-20、H-17a/H-17b 与 C-15/C-2UH3-18 与 C-19、H-21a/H-21b 与 C-17/C-20、H-20 与 C-19/C-21 存在相关信号，结合 13C-NMR 谱中相关碳信号暗示结构中存在连氧六元环片段。同时，在HMBC谱中还显示存在H-5与C-3/ C-7/C-17、H2-14与C-UAi-Me与C-2/C-13相关信号，可构建该化合物的相关碳氢连接方式。 N0ESY谱中，H-3与H-5的相关信号表明两者构型一致；同时，H-20与H-14a/ H-21a的相关信 号表明H-20为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据， 可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一 致。
[0020]
[0021] 实施例2:化合物(I)药理作用试验 一、材料和仪器 人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库(美国）。分析纯蔗糖购于国药集团化学试剂公司。 重水(D20)购于青岛腾龙微波科技有限公司。Tris、SDS、30%丙烯酰胺单体、Tween20购于重 庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。Centriplus离心 超滤管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管（100kD)、PVDF膜购于Millipore 公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5XSDS-PAGE蛋白质上样缓冲 液、BeyoECL荧光检测试剂、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250购于碧云天生物技术研究所。 化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%。鼠抗人HSP70单克隆抗体、兔抗人ICAM-1单克隆 抗体、兔抗人G250多克隆抗体购于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗体武汉博士德生物 有限公司。
[0022] 超净工作台（苏州华新空调净化有限公司），自动平衡离心机(上海医用分析仪器 厂），光学显微镜(NIKON，日本），透射电子显微镜(LeicaTCS-NT，德国），低温高速离心机（日 立公司，日本），低温超高速离心机H-80B(日立公司，日本）。垂直电泳槽、电转槽(北京六一 厂，中国）。台式高速离心机、酶标仪(上海安亭科学仪器厂，中国）。96孔培养板(Corning公 司，美国）。凝胶仪、PCR扩增仪(BI0-RAD，美国）。
[0023]二、试验方法 1、MTT检测化合物（I)不同浓度48h对肾癌细胞株RC-2增殖的影响 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(含有0.1%青霉素、链霉素)常规培养人肾癌细胞 株RC-2，根据细胞生长密度1~2天换液一次，3天传代一次。取对数期生长细胞，按照如下步 骤操作：（1)接种细胞：胰酶消化对数生长期的肾癌RC-2细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液lmL制成单细胞悬液，混匀后用移液管按照体积100μL孔，即接种肾癌细胞数目 5 X 103个/孔，加入96孔培养板中。每组细胞设置3个复孔；（2)培养细胞:将培养板小心置入 孵箱中（37 °C、5%C02)培养3天；（3)处理细胞：分别按空白组（加5yL DMS0液）、0.25、0.5、 0.75、lymol/L化合物（I)处理组分组后加药处理48h; (4)显色:在各个时间点，予以每孔各 加入MTT溶液20yL，之后继续放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔内培养液用注射器吸去；对 于当天接种的细胞而言，离心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后将孔内培养液移除。之后把150yL DMS0加入每孔，使其充分振荡10min后，把结晶物溶解完全；（5)比色：在全自动酶标仪上检 测各孔在580nm波长下的光密度值[(D580)]，按公式测定细胞活力:D(580)实验孔/D(580) 对照孔X 100%。
[0024] 2、MTT检测0.5μΜ化合物（I)不同时间对肾癌细胞株RC-2增殖的影响 接种和处理细胞及显色和比色步骤同上（1)、（2)、（4)、（5)，处理细胞:分别按空白组 (加5yL DMS0液）、0·5μΜ化合物（I)处理24h、48h、72h分组。
[0025] 3、制备 exosomes (1)细胞分组:取6份细胞计数相近的人肾癌RC-2细胞株体外常规培养，其中三份为对 照组(CE)，另外三份为实验组(CE2)，等细胞呈对数生长时，两组细胞株按照3 X 106/100mL 重新传代至新的培养瓶，严格控制每组细胞培养基的体积一致;在实验组，等细胞培养48h 后加入0.5μΜ的化合物（I)处理细胞48h，之后收集培养上清液各150 mL;对照组不加药物， 加入与实验组等量的DMS0,48h后收集培养上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提取 exosomes:培养上清液150mL，300g低温离心（4°C )10min去除细胞;800g低温离心30min获取 上清10000g低温离心30min获取上清通过100kD MW⑶Centriplus离心超滤管浓缩超滤 (MWC0:分子量截留），以1000g离心30min，得到约20mL超滤液。将超滤液分别移至2mL含30g/ L的蔗糖重水垫的10mL的离心管中，100000g低温超速离心lh。收集离心管底部的缓冲垫用 PBS稀释，置于100kD MWC0高回收率高流速切向流超滤离心管中1000g离心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι滤膜过滤除菌，_80°C保存备用设置对照组细胞(CE1)来源的exosomes为 EX1 组 exosomes，实验组细胞(CE2)来源的 exosomes 为EX2 组 exosomes。
[0026] 4、BCA法检测exosomes蛋白含量 (1)测定方法:取96孔酶标板，按下表加入试剂并绘制标准曲线：
上述试剂加完后，准确吸取l〇yL样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200yL，轻摇，于37 °C保温30min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋白含 量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光 值从标准曲线上查出样品的蛋白质浓度；（2)计算方法:exosome浓缩液总蛋白质含量(mg)= 浓缩后的总体积X BCA法测定蛋白质浓度。重复6次实验，取平均值做统计学分析。
[0027] 5、统计学方法 使用软件GRAGHPAD PRISM 5.0进行图表制作及统计学分析，计量资料以X ±s表示， 比较组间差异使用方差分析或t检验。
[0028]三、结果及结论 1、MTT显示不同浓度化合物（I)作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化 MTT结果显示当化合物（I)浓度0.75μΜ作用细胞时，细胞活力(71.32 ± 4.68%)与化合物 (1)浓度0.5以1及0.25以1作用细胞时细胞组（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比，差异具有 统计学意义(Ρ〈〇.〇5)。
[0029] 2、ΜΤΤ显示0.5μΜ化合物（I)不同时间作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化 11'1'结果显示当0.5以]?化合物（1)作用细胞7211组(71.34±1.64%)与作用4811组(91.04± 6 · 23%)、24h组(94· 56± 1 · 13%)对比，细胞活力差异具有统计学意义(P〈0 · 05)。
[0030] 3、Exosomes计数和蛋白定量 电镜下实验组(EX2)和对照组(EXl)exosomes计数和exosomes蛋白定量结果:经化合物 (I)处理后，RC-2细胞产生的exosomes数量和exosome蛋白含量较未经药物处理组都明显增 加，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。结果见表1。
[0031]结果说明，化合物（I)能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖 性。经化合物（I)处理后，透射电镜观察肾癌细胞株RC-12源性exosomes形态未见明显改变， 其分泌量和蛋白含量较处理前明显增加(P<〇. 05)，这些说明化合物（I)对肾癌细胞株RC-12的抑制作用与化合物（I)引起的肾癌细胞RC-2表达野生型p53mRNA上调有关。
[0032] 表1实验组和对照组分泌exosomes数量及蛋白含量对比
实施例3 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或 甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例 加入赋形剂，制粒压片。
[0033] 实施例4 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或 甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
[0034] 实施例5 胶囊剂或颗粒剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比 为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0035] 实施例6 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸 或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封 灭菌制成注射液。
[0036] 实施例7 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅 拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉 针剂。
[0037] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将延胡 索的干燥块根粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、 乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用75% 乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中 75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、55:1、35:1、15:1和1:1的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积 比为20:1、15:1和10:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分;（e)步骤(d)中组分2用十八 烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为80%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个 柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，用85%乙醇热 回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于:该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化 合物(I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗肾癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
【文档编号】A61P13/12GK105906645SQ201610320548
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】徐珍
【申请人】苏州毕诺佳医药技术有限公司