一种莱菔素衍生物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种莱菔素衍生物的制备方法，属于抗癌化合物领域。该方法较传统方法相比，主要利用了结晶法代替传统的制备色谱法，能够显著降低制备成本，能够实现大规模的制备。该方法主要包括还原型谷胱甘肽与莱菔素粗产品进行反应，利用乙醇等能与水互溶的有机溶剂与水混合对反应反应产物结晶。结晶产品纯度为96％，并且大批量制备莱菔素?谷胱甘肽结合物。
【专利说明】
一种莱菔素衍生物的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种莱菔素衍生化合物的制备及纯化工艺，尤其是莱菔素-谷胱甘肽 结合物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，便不再停止生长，他的 生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良 性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处 转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患 者死亡。
[0003] 肿瘤的治疗方法有手术治疗、放射治疗和药物治疗（即化疗)等，其中化学治疗为 目前主要的治疗手段。化学治疗能治愈一部分肿瘤患者或延长患者的生命，在肿瘤治疗中 占有越来越重要地位。但是，传统的抗肿瘤药物对癌症细胞的杀灭率较低或需要较高的浓 度，因此产生了许多严重的毒副反应。随着生活水平的提高，人们对于癌症的治疗预期显著 提高，希望在治愈癌症的时候身体健康不受到很大的影响，因此，发现新的、高效抗肿瘤化 合物显得尤为迫切。
[0004] 莱菔素是中药莱菔子中提取的一种天然活性成分，与莱菔硫烷结构相近，也因此 与莱菔硫烷的抗癌效果相近。但是由于其结构不稳定，无法长期储存，严重限制了其应用。 莱菔素可与还原型谷胱甘肽等含巯基类的物质结合，使容易降解的基团被保护起来，并保 留了其抗癌活性，形成了全新的抗癌化合物。本发明的主要内容是研究了一种莱菔素衍生 物，莱菔素-谷胱甘肽结合物的制备方法，该方法代替了原有的利用纯品莱菔素参与反应及 利用制备型高效液相色谱纯化的途径。
[0005] 本发明的具体方法和步骤如下：
[0006] 本发明的目的是提供一种莱菔素衍生物，莱菔素-谷胱甘肽结合物的制备方法，该 结合物的化学式为：
[0008] -种莱菔素衍生物的制备方法，其特征在于：
[0009] (1)还原型谷胱甘肽溶于将还原型谷胱甘肽溶于1至1000体积倍的去离子水中将 其溶解。
[001 0] (2)在还原型谷胱甘肽溶液中加入莱菔素，（莱菔素纯度为0.1 % -100 % )，还原型 谷胱甘肽与莱菔素的摩尔比例为100:1至1:100。
[0011] (3)控制温度在0°C至80°C，反应1至144小时。
[0012] (4)若反应体系固含量大于5%，贝lj加入去离子水，将反应液固含量稀释至1 %-5% 之间。若反应体系固含量小于1 %，则通过旋转蒸发仪浓缩反应液，至反应液固含量为1 % _ 5%〇
[0013] (5)过滤除去不溶性的杂质后，向反应液中加入0.1至500体积倍的与水互溶的有 机溶剂，控制温度在〇°C至100°C，搅拌lmin至120min，在-20°c至20°C下结晶。
[0014] (6)过滤后乙醇洗涤，干燥即得。
[0015] 除非另有说明，本文所描述的每一步所加入成分配比均为质量比。
[0016] 所述制备方法中，所加入的与水互溶的有机溶剂可以为乙醇，甲醇，乙腈，异丙醇 等药学上可接受的有机溶剂。
【附图说明】
[0017] 图1为化合物的质谱图谱。
[0018] 图2为化合物的红外图谱。
[0019] 图3为化合物的1H-NMR图谱。
[0020] 图4为化合物的13C-NMR图谱。
[0021] 图5为化合物的制备色谱图谱。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但这些实施例的目的并不在于限 制本发明的保护范围。
[0023] 实施例1
[0024]将10g还原型谷胱甘肽溶于100ml去离子水中，向其中加入10g纯度为质量百分比 96%莱菔素，25°C反应16小时。
[0025] 加入300ml去离子水，50 °C搅拌30min溶解，过滤除去不溶性杂质，加入1600ml的无 水乙醇，控制温度为75°C搅拌lh，置于4°C下结晶。
[0026] 将结晶析出固体过滤，用100ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得14.8g，纯度为97.5% 的广品。
[0027] 实施例2
[0028]将5g还原型谷胱甘肽溶于500ml去离子水中，向其中加入10g纯度为50%莱菔素， 35 °C反应40小时。
[0029]利用旋转蒸发仪50°C，压力45mbar，将反应体系浓缩至200ml。过滤除去不溶性的 杂质，加入1800ml的无水甲醇，控制温度在65°C下搅拌40min，置于0°C下结晶。
[0030] 将结晶析出固体过滤，用50ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得7.0g，纯度为92.9%的 广品。
[0031] 实施例3
[0032]将lg还原型谷胱甘肽溶于100ml去离子水中，向其中加入5g纯度为20%莱菔素，40 。(:反应48小时。
[0033]利用旋转蒸发仪55°C，压力50mbar，将反应体系浓缩至20ml。过滤除去不溶性的杂 质，加入180ml的乙腈，控制温度在80°C下搅拌20min，置于-10°C下结晶。
[0034] 将结晶析出固体过滤，用10ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得1.5g，纯度为95.3 %的 广品。
[0035] 实施例4
[0036]将10g还原型谷胱甘肽溶于200ml去离子水中，向其中加入15g纯度为75%莱菔素， 室温反应26小时。
[0037] 加入100ml去离子水，60 °C搅拌溶解20min，过滤除去不溶性杂质，加入2000ml异丙 醇，控制温度在85 °C下搅拌20min，置于室温结晶。
[0038] 将结晶析出固体过滤，用100ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得15 . lg，纯度为94.5% 的广品。
[0039] 实施例5
[0040]将10g还原型谷胱甘肽溶于200ml去离子水中，向其中加入15g纯度为75%莱菔素， 室温反应25小时。
[0041 ] 加入100ml去离子水，60 °C搅拌溶解20min，过滤除去不溶性杂质，加入2000ml异丙 醇，控制温度在85 °C下搅拌20min，置于室温结晶。
[0042] 将结晶析出固体过滤，用100ml无水乙醇洗涤3次，烘干即得15 . lg，纯度为95.5% 的广品。
[0043] 实施例6
[0044] -、材料和方法
[0045] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺鳞癌细胞系H460购买自美国ATCC细胞库，培 养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0046] 2.化合物对H460血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的H460细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在H460细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150此的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验结果数据见 表1。
[0047] 二、实验结果
[0048]表1显示，化合物对H460人肺鳞癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小 时后，化合物对的H460细胞生长的半数抑制浓度(IC5Q)为9.116yM。
[0049] 实施例7
[0050] -、材料和方法
[00511 1.实验细胞系和相关化学试剂：人宫颈癌细胞系Hela购买自美国ATCC细胞库，培 养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0052] 2.化合物对Hela血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的Hela细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在Hela细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150此的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验结果数据见 表1。
[0053]二、实验结果
[0054]表1显示，化合物对Hela人宫颈癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小 时后，化合物对的Hela细胞生长的半数抑制浓度(IC5Q)为14.92yM。
[0055] 实施例8 [0056] 一、材料和方法
[0057] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺癌细胞系H446购买自美国ATCC细胞库，培养 在含10%胎牛血清的RPMI_1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA常 规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0058] 2.化合物对H446血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的H446细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在H446细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150此的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验结果数据见 表1。
[0059] 二、实验结果
[0060]表1显示，化合物对H446人肺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小时 后，化合物对的H446细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为6.098yM。
[0061 ] 实施例9 [0062] 一、材料和方法
[0063] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人皮肤黑色素瘤细胞系A375购买自美国ATCC细胞 库，培养在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇116)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0064] 2.化合物对A375血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的A375细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在A375细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150此的DMS0,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验结果数据见 表1。
[0065] 二、实验结果
[0066]表1显示，化合物对A375人皮肤黑色素瘤细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处 理48小时后，化合物对的A375细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为17.515yM。
[0067] 实施例10 [0068] 一、材料和方法
[0069] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人乳腺癌细胞系MCF-7购买自美国ATCC细胞库，培 养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0070] 2.化合物对MCF-7血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MCF-7细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22mi滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1虚、2虚、3虚、5處、10虚、20虚和50處，在]\〇 7-7细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150此的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)，实验结果数 据见表1。
[0071] 二、实验结果
[0072] 表1显示，化合物对MCF-7人乳腺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48 小时后，化合物对的MCF-7细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为9.599yM。
[0073] 实施例11 [0074] 一、材料和方法
[0075] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人非小细胞肺癌细胞系A549购买自美国ATCC细胞 库，培养在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇116)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0076] 2.化合物对A549血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的A549细胞消化成单个细 胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用无 菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度为 lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在A549细胞接种培养24小时后，换成含有化合物相应 浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分 别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净每孔 中的溶液，分别加入150此的DMSO,摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小 时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验结果数据见 表1。
[0077]二、实验结果
[0078]表1显示，化合物对A549人非小细胞肺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处 理48小时后，化合物对的A549细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为9.154yM。
[0079] 实施例12 [0080] -、材料和方法
[00811 1.实验细胞系和相关化学试剂：人非小细胞肺癌细胞系H1299购买自美国ATCC细 胞库，培养在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：10116)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0082] 2.化合物对H1299血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的H1299细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22mi滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1虚、2虚、3虚、5處、10虚、20虚和50處，在111299细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150此的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)，实验结果数 据见表1。
[0083] 二、实验结果
[0084]表1显示，化合物对H1299人非小细胞肺癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。 处理48小时后，化合物对的H1299细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为8.333yM。
[0085] 实施例13
[0086] -、材料和方法
[0087] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人肝癌细胞系HepG2购买自美国ATCC细胞库，培养 在含10%胎牛血清的RPMI_1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA常 规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0088] 2.化合物对HepG2血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的HepG2细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22mi滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1虚、2虚、3虚、5處、10虚、20虚和50處，在他?62细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养48小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150此的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)，实验结果数 据见表1。
[0089] 二、实验结果
[0090] 表1显示，化合物对HepG2人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理48小 时后，化合物对的IfepG2细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为8.776yM。
[0091] 实施例14
[0092] 一、材料和方法
[0093] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-453购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0094] 2.化合物对MDA-MB-453血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-453细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1處、2處、3虚、5虚、10虚、20虚和50虚，在]\?从-]\?-453细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC 5Q)，实验结果数据见表1。
[0095] 二、实验结果
[0096]表1显示，化合物对MDA-MB-453人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-453细胞生长的半数抑制浓度(IC5Q)为3.08yM。
[0097] 实施例15 [0098] 一、材料和方法
[0099] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-231购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0100] 2.化合物对MDA-MB-231血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-231细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1處、2處、3虚、5虚、10虚、20虚和50虚，在]\?从-]\?-231细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC 5Q)，实验结果数据见表1。
[0101] 二、实验结果
[0102]表1显示，化合物对MDA-MB-231人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-231细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为8.71yM。
[0103] 实施例16 [0104] 一、材料和方法
[0105] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-436购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0106] 2.化合物对MDA-MB-436血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-436细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1處、2處、3虚、5虚、10虚、20虚和50虚，在]\?从-]\?-436细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC 5Q)，实验结果数据见表1。
[0107] 二、实验结果
[0108] 表1显示，化合物对MDA-MB-436人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-436细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为3.45yM。
[0109] 实施例17 [0110] 一、材料和方法
[0111] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人TNBC亚型的乳腺癌细胞系MDA-MB-468购买自美 国ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0112] 2.化合物对MDA-MB-468血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MDA-MB-468细胞 消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37°C培养箱中培养。 将化合物用无菌去离子水溶解后，过〇. 22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II 的最终浓度为1處、2處、3虚、5虚、10虚、20虚和50虚，在]\?从-]\?-468细胞接种培养24小时后， 换成含有化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离 子水培养细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°C培养箱继续 孵育3h后，洗净每孔中的溶液，分别加入150yL的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长 下的吸光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度 (IC 5Q)，实验结果数据见表1。
[0113] 二、实验结果
[0114] 表1显示，化合物对MDA-MB-468人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理 72小时后，化合物对的MDA-MB-468细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为3.59yM。
[0115] 实施例18
[0116] 一、材料和方法
[0117] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人ER+亚型的乳腺癌细胞系MCF-7购买自美国ATCC 细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0118] 2.化合物对MCF-7血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的MCF-7细胞消化成单个 细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合物用 无菌去离子水溶解后，过0.22mi滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终浓度 为1虚、2虚、3虚、5處、10虚、20虚和50處，在]\〇7-7细胞接种培养24小时后，换成含有化合物 相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。 再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培养箱继续孵育3h后，洗净 每孔中的溶液，分别加入150此的DMSO，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸光度。以 〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)，实验结果数 据见表1。
[0119] 二、实验结果
[0120]表1显示，化合物对MCF-7人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72小 时后，化合物对的MCF-7细胞生长的半数抑制浓度（IC5Q)为3.48yM。
[0121] 实施例19
[0122] 一、材料和方法
[0123] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人ER+亚型的乳腺癌细胞系ZR-75-1购买自美国 ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0124] 2.化合物对ZR-75-1血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的ZR-75-1细胞消化成 单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合 物用无菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终 浓度为lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在ZR-75-1细胞接种培养24小时后，换成含有 化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养 细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%raJ^37°C培养箱继续孵育3h 后，洗净每孔中的溶液，分别加入150此的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸 光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验 结果数据见表1。
[0125] 二、实验结果
[0126] 表1显示，化合物对ZR-75-1人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72 小时后，化合物对的ZR-75-1细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为2.82yM。
[0127] 实施例20
[0128] 一、材料和方法
[0129] 1.实验细胞系和相关化学试剂：人ER+亚型的乳腺癌细胞系ZR-75-1购买自美国 ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0130] 2.化合物对ZR-75-1血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的ZR-75-1细胞消化成 单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合 物用无菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终 浓度为lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在ZR-75-1细胞接种培养24小时后，换成含有 化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养 细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%raJ^37°C培养箱继续孵育3h 后，洗净每孔中的溶液，分别加入150此的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸 光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验 结果数据见表1。
[0131] 二、实验结果
[0132] 表1显示，化合物对ZR-75-1人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72 小时后，化合物对的ZR-75-1细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为2.82yM。
[0133] 实施例21
[0134] 一、材料和方法
[0135] 1.实验细胞系和相关化学试剂:人HER2+亚型的乳腺癌细胞系Sk-br-3购买自美国 ATCC细胞库，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
[0136] 2.化合物对Sk-br-3血细胞的体外抑制实验:取对数生长期的Sk-br-3细胞消化成 单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5 % 0)2的37 °C培养箱中培养。将化合 物用无菌去离子水溶解后，过0.22wii滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使得结合物II的最终 浓度为lyM、2yM、3yM、5yM、10yM、20yM和50yM，在Sk-br-3细胞接种培养24小时后，换成含有 化合物相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养 细胞。再分别培养72小时后，每孔加入20yL MTT，在含有5%raJ^37°C培养箱继续孵育3h 后，洗净每孔中的溶液，分别加入150此的DMS0，摇床震荡lOmin，测定每孔490nm波长下的吸 光度。以〇小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC 5Q)，实验 结果数据见表1。
[0137] 二、实验结果
[0138] 表1显示，化合物对Sk-br-3人肝癌细胞的生长增值具有显著的抑制效果。处理72 小时后，化合物对的Sk-br-3细胞生长的半数抑制浓度（IC 5Q)为2.82yM。
[0139] 表1为结构式II在多种肿瘤细胞中的48小时的I (：50值
[0140] 表2为结构式II在不同亚型乳腺癌中72小时的1(：50值
【主权项】
1. 一种莱廉素衍生物，其化学式如下：2. 权利要求1所述的衍生物在制备用于治疗人的肿瘤的药物中的应用。3. 权利要求1所述的衍生物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。4. 药物组合物，包含权利要求1所述的衍生物W及药学辅料。5. 按照权利要求4所述的药物组合物，是片剂、胶囊剂、粉针剂、液剂或混悬剂形式。6. 制备如权利要求1所述的一种莱廉素衍生物的方法，其特征在于： (1) 还原型谷脫甘肤溶于将还原型谷脫甘肤溶于1至1000体积倍的去离子水中将其溶 解； (2) 在还原型谷脫甘肤溶液中加入莱廉素，还原型谷脫甘肤与莱廉素的摩尔比例为 100:1至1:100; (3) 控制溫度在0°C至80°C，反应1至144小时； (4) 若反应体系固含量大于5 %，则加入去离子水，将反应液固含量稀释至1 %-5 %之 间；若反应体系固含量小于1 %，则通过旋转蒸发仪浓缩反应液，至反应液固含量为1%- 5%; (5) 过滤除去不溶性的杂质后，向反应液中加入0.1至500体积倍的与水互溶的有机溶 剂，控制溫度在〇°C至100°C，揽拌Imin至120min，在-20°C至20°C下结晶； (6) 过滤后乙醇洗涂，干燥即得。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:有机溶剂为乙醇，甲醇，乙腊或异丙醇。
【文档编号】C07K1/113GK105968171SQ201610320292
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月15日
【发明人】袁其朋, 王忠鹏, 程立, 田桂芳, 况鹏群, 任萌, 刘玉婷
【申请人】北京化工大学