环氧蟾毒烯酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的用图
【专利摘要】本发明属于中药蟾酥中抗肿瘤活性成份制备领域。本发明提取的化合物分子式C24H28O，化学名7,14?epoxy?3α?hydroxy?7?en?15?bufalinone，命名为环氧蟾毒烯酮。获得方法为：将片状蟾酥研成粗粉，分别用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水加热回流提取，丙酮提取液减压回收得浸膏;将丙酮部位浸膏通过MCI柱，甲醇?水梯度洗脱，薄层层析检测得到8个部分Fr1?Fr8;将Fr1部位通过二醇基硅胶柱 CH2Cl2?MeOH 梯度洗脱，Sephadex LH?20柱甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有化合物的流份；浓缩后，析出结晶，抽滤出结晶即得。动物实验表明该化合物具有抗肿瘤的功效。
【专利说明】
环氧蟾毒烯酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的用途
技术领域
[0001] 本发明属于中药有效成份的提取和运用领域，尤其是中药蟾酥中的具体抗肿瘤活 性成份化合物的制备领域。
【背景技术】
[0002] 蟾酥是蟾蜍表皮腺体的分泌物，白色乳状液体，有毒，干燥后可以入药。味甘、辛， 性温，有毒，主治小儿疳疾、脑疳以及背部疔疮。蟾酥的化学成分比较复杂，现代药理研究发 现蟾酥中主要含有多种强心留体类化合物。通过对蟾酥的分离和鉴定，目前已确定其主要 化学成分按结构分类如下：
[0003] (1)强心甾体类化合物，可分为：蟾毒配基类（131^(^61^1^，868)、脂蟾毒配基 (resibufogenin，RBG)、华蟾毒配基（cinobufagin，CBG)、远华蟾毒配基（telocinobufagin， TCBG)、蟾毒灵（bufalin，BL)、华蟾毒它灵（cinobufatalin)、日蟾毒它灵 (gamabufotalinin)及南美蟾毒精等。
[0004] (2)吲哚类生物碱及其衍生物，此类化合物含有吲哚环，是具有一定生物活性的水 溶性吲哚生物碱，包含:蟾酥碱、蟾酥甲碱、5 -羟色胺、去氢蟾酥碱等。
[0005] (3)甾醇类，蟾酥含有胆甾醇、7a -羟基胆甾醇、70-羟基胆甾醇』一谷甾醇、麦角 留醇等。
[0006] (4)其他类:近年来新发现的一些成分，有20,21-环氧蟾毒内酯、20S，21 -环氧蟾 毒配基、20R，21 -环氧瞻毒配基、3 - 0一甲駿基一20S，21环氧瞻毒配基、3 - 0一20S，21 -环 氧蟾毒配基等;蟾酥中尚含有肾上腺素及多种氨基酸。目前研究表明，蟾酥及其活性成分具 有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡等作用。其中以有脂蟾毒配基、蟾毒灵和华蟾毒配 基类化合物被认为是蟾酥抗肿瘤作用的主要活性成份。
【发明内容】
[0007] 发明所要解决的技术问题
[0008] 在中药蟾酥中分离出一种具有抗肿瘤活性的化合物，并能确定其结构式。
[0009] 发明采取的技术方案
[0010] 具有以下结构式I所代表的化合物，
[0012] 进一步，获得该化合物的方法为:将片状蟾酥研成粗粉，分别用石油醚、乙酸乙酯、 丙酮、甲醇和水加热回流提取，丙酮提取液减压回收得浸膏;将丙酮部位浸膏通过MCI柱，甲 醇-水梯度洗脱，薄层层析检测，得到8个部分Frl-Fr8;将Fr 1部位通过二醇基硅胶柱CH2C12-MeOH梯度洗脱，Sephadex LH-20柱甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有化合物的流份;浓缩 后，析出结晶，抽滤出结晶即得。
[0013] 更进一步，该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0014] 发明的有益效果
[0015] 首次公开了本发明化合物的结构及其制备方法，并且将其应用到抗肿瘤药物领 域。
【附图说明】
[0016] 图1环氧蟾毒烯酮的H-H COSY相关数据(H-H)
[0017]具体实施方法
[0018] 一、本发明化合物的结构
[0019]本发明为从中华大蟾蜍耳后腺分泌物干燥品蟾酥中分离得到的1个新的蟾毒甾二 烯类新化合物，结构式(I)如下：
[0021 ]命名为环氧蟾毒稀酮（epoxybufal inenone)，英文化#SS:7，14-epoxy_3a-hydroxy-7-en-l5-bufalinone 〇
[0022] 本发明的环氧蟾毒烯酮为白色针晶，mp 127.8-129.0°C，ESI-MS:m/z 397[M+H]+， 结合1H NMR(400MHz)和13C NMR(lOOMHz)数据推断化合物分子式为C24H28〇5</3C NMR中有一 组8162.6，150.5，147.1，121.2，115.5信号以及111匪1?中的57.46(111，(1，了=1.8他，11-21)， 7.76(lH，dd，J = 9.7，1.8Hz，H-22)，6.25(lH，d，J = 9.7Hz，H-23)信号是蟾毒甾二烯类的特 征信号，因此推定为蟾毒留二烯类化合物。S200.3(C-15)提示酮羰基结构，S66.7(C-3)及 4.06(br s，H-3)提示氧取代次甲基结构，S141.0(C-7)、133.8(C_8)季碳信号提示为四取代 烯结构，结合分子式及不饱和度分析，化合物分子中还含有1个含氧环结构。通过H-H COSY 对化合物H信号进行归属（见图1)，通过2D-NMR(HSQC，HMBC)对C谱和H谱的化学位移进行完 全归属（见表 1)，推定化合物为7，14-epoxy-3a-hydroxy-7-en-15_bufalinone。
[0023]表 1 环氧蟾毒烯酮的1H NMR(400MHz)，13C NMR(100MHz)，HMBC数据(CDC13)
[0025]
[0026] *表示H化学位移和积分面积重叠。
[0027]二、本发明化合物的提取方法：
[0028]将片状蟾酥研成粗粉，分别用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水加热回流提取，丙 酮提取液减压回收得浸膏;将丙酮部位浸膏通过MCI柱，甲醇-水梯度洗脱，薄层层析检测， 得到8个部分Fr 1-Fr8;将Frl部位通过二醇基硅胶柱CH2Cl2_MeOH梯度洗脱，S印hadex LH-20 柱甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有化合物的流份;浓缩后，析出结晶，抽滤出结晶即得。 [0029]三、本发明化合物抑制肿瘤细胞生长的用途 [0030] 实验方法:MTT测活法
[0031]实验材料:人非小细胞肺癌细胞株A549 (中国科学院细胞库），MTT，DMEM高糖培养 基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，96孔板(Corning)
[0032] 1.接种肺癌细胞株A549细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液， 以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100u 1。
[0033] 2.5 %⑶2，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板），加入浓度梯度的药物， 设5个梯度，2-3个复孔。
[0034] 3.5%C〇2,37°C继续孵育44小时，在蔡司倒置荧光显微镜下观察。
[0035] 4?每孔加入10ul MIT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。
[0036] 5 ?终止培养，小心吸去孔内培养液。
[0037] 6.每孔加入150ul DMS0(二甲基亚砜），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶 解。在全波长酶标仪〇D490nm处测量各孔的吸光值。
[0038] 8.统计细胞生长抑制状况，抑制率计算公式：
[0039] 抑制率=(control 组-加药组）/(control 组-blank)
[0040] 计算结果见表2
[0041 ]表2不同浓度药物刺激48h对A549损伤的影响(n = 5)
[0043]四、结论
[0044]分析实验结果及与文献对照，可得到本发明的化合物环氧蟾毒烯酮具有明显的抑 制肺癌细胞作用，其显著细胞毒活性的IC50值在0.226±0.175yM(无 tSD),
【主权项】
1. 具有W下结构式I所代表的化合物：2. 如权利要求1所述的化合物的制备方法，具体为:将片状赡酥研成粗粉，分别用石油 酸、乙酸乙醋、丙酬、甲醇和水加热回流提取，丙酬提取液减压回收得浸膏;将丙酬部位浸膏 通过MCI柱，甲醇-水梯度洗脱，薄层层析检测，得到8个部分Frl-扣8;将Frl部位通过二醇基 硅胶柱C出Cl2-MeOH梯度洗脱，Sephadex LH-20柱甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有化合物 的流份;浓缩后，析出结晶，抽滤出结晶即得。3. 如权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK105968167SQ201610291860
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】钱士辉, 赵彦敏, 李振麟, 曹鹏, 孙晓艳, 左其艳
【申请人】江苏省中医药研究院