嘧啶衍生物、细胞毒性剂、药物组合物及其应用

嘧啶衍生物、细胞毒性剂、药物组合物及其应用
【专利摘要】一种式(Ⅰ)所示的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐，其中，R1、R2、R0如说明书所述，其用于制备细胞毒性剂以及抗肿瘤药物。
【专利说明】嘧啶衍生物、细胞毒性剂、药物组合物及其应用
[0001] PI3K/Akt/mT0R信号通路是细胞信号传导通路中非常重要的一条通路，它对细胞 的很多重要生理功能都有调控作用，比如细胞生长、增殖、分化、迀移、存活、血管生成、葡萄 糖代谢以及细胞膜的波动等 [1'2]。
[0002] PI3K激酶是一个复杂的脂酶家族，包括IA型、IB型、II型、III型和IV型（PI3K 相关激酶）。IA型PI3k由受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK)激活，包 括一个调节亚基P85和一个催化亚基pllO,根据催化亚基的不同IA型PI3k分为pllO a、 0和S三个亚型。IB型PI3k只有一个pllOy亚型，它包括一个a pllOy催化亚基和 一个plOl的调节亚基组成，通过G-蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor)激活。 I型PI3K能够催化磷酸化4, 5-磷脂酰肌醇二磷酸盐（phosphatidylinositol (4, 5)-bisp 11〇8口1^七6，？1?2)3位的羟基生成一个信号分子3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸盐&11〇8口1^1:1(17 linositol (3, 4, 5)-trisphosphate，PIP3)，PIP3 能够激活下游的 H3K1 和 Akt 激酶实现信 号的传导。在细胞内 PIP3 的浓度还受 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的调控，PTEN的作用是诘抗PI3K对下游通路的激活，它最重要的功能 是在磷酸肌醇的3位上起到去磷酸化的作用，使PI3K产生的信号分子PIP3去磷酸化变回 PIP3 从而反向调节 PI3K 信号[1'3'4]。II 型 PI3K 包括 PI3K-C2a、PI3K-C2 0 和 PI3K-C2y 三个亚型，它能够磷酸化磷脂酰肌醇和4-磷脂酰肌醇磷酸盐但是不能磷酸化4, 5-磷脂酰 肌醇二磷酸盐（PIP2)[5]。III型PI3K只有一个成员Vps34,它只能磷酸化磷脂酰肌醇生成 3_磷脂酰肌醇磷酸盐，在的功能与蛋白质转运和自噬有关 [6]。IV型PI3K包含和其他PI3K 激酶相似的催化区域，其成员包括mTOR、ATR、ATM、DNA-PK[ 4'7]。
[0003] PI3K信号通路的失调或者异常活跃与许多疾病的发生都有密切的关联。在多种 肿瘤中都发现了由于突变导致的PllO a过度表达，在超过30%的实体瘤中都发现了编码 pll〇a的PIK3CA基因的突变m，在40%卵巢癌和50%的宫颈癌中发现了 PIK3CA的突变 ^PllOS和y是白细胞信号系统中的关键酶，通过抑制它们的活性能够治疗炎症和自免 疫相关的疾病 [9]。有证据显示P11O0在PTEN缺失导致的肿瘤生成中起着关键的作用，在 体内和体外下调编码pll〇 0的PIK3CB基因的表达能抑制PI3K的信号并抑制肿瘤的生长 [1°]。近些年来，随着人们对PI3K结构功能研究的深入，PI3K在众多疾病中的作用也越来越 清楚，PI3K已经成为非常有前景的药物靶点。因此，开发以PI3K为靶点的抑制剂成为药物 化学界研究的热点并且已经有大量的PI3K抑制剂被报道出来，已经有不少化合物处于临 床研究阶段。目前，已经报道的PI3K抑制剂主要分为以下几类：
[0004] 一、非选择性的I型PI3K抑制剂
[0005] LY294002and wortmannin (结构如式一）是最早的一代非选择性的I型PI3K抑制 剂，它们都抑制pll〇催化亚基。LY294002是礼来公司开发的一类可逆的ATP竞争性的抑制 剂，它不但能抑制I型PI3K还能抑制mTOR及DNA-PK。Wortmannin是从真菌中分离出来的 天然产物，它通过和pll〇a的Lys802残基和pllOy的Lys833残基产生共价作用而发挥 作用。由于它们的毒副作用、差的药理学性质和缺乏选择性并没有进一步的临床开发 [11'12]。 [0006] XL147 (结构如式一）是新一代的I型PI3K抑制剂，它对pllO a、S和y抑 制活性分别为IC50 = 39、383、23和36nM并且对VPS34、DNA-PK和mTOR没有抑制活性。在 体外肿瘤细胞抑制试验中，XL147能够抑制肿瘤细胞的PI3K信号传导，在临床前的乳腺癌、 肺癌、卵巢癌、前列腺癌体内模型中，它能引起肿瘤生长减缓和收缩。XL147已经进入临床试 验阶段，在临床阶段将评价其单独用药或者联合用药对实体瘤、淋巴瘤和转移的乳腺癌等 多种肿瘤的安全性和有效性 [1]。
[0007] DGC-0941 (结构如式一）是一类口服有效的I型PI3K抑制剂，对pllO a、0、S 和Y抑制活性分别为IC50 = 3、33、3和75nM并且在细胞中测试抑制AKT磷酸化的试验中 IC50 = 28nm[11]。⑶C-0941 能以较低的 IC50 值抑制 U87MG、PC3、SK0V-3、IGR0V-l、Detroit 562、HCT116、SNUC2B和LoVo细胞系。⑶C-0941在无胸腺小鼠U87MG和IGR0V-1移植模型 中也有很好的作用。目前，⑶C-0941也处于临床研究阶段 [13]。
[0008] BKM120 (结构如式一）是一种有效的I型PI3K抑制剂，对pllO a、0S和y抑 制活性分别为IC50 = 52、166、116和26InM，它对III型和IV型PI3K表现出了较低的抑制 活性，对mTO R和其他蛋白激酶比如HERUJAK2和TOK1至少有50倍的选择性。BKM120在 细胞和肿瘤移植模型中都能够有效降低AKT的磷酸化水平，它还能抑制BCR和细胞趋化性， 增加慢性粒细胞白血病细胞对苯达莫司汀和磷酸氟达拉滨的敏感性并且对正常淋巴细胞 的毒性小 [14]。目前，BKM120治疗急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、与INC424合用 治疗骨髓纤维化、与利妥昔单抗合用治疗B细胞淋巴瘤都处在一期临床试验阶段（http:// www. clinicaltrials. gov/)〇
[0009] 二、选择性PI3K抑制剂
[0010] CAL-101 (Idelalisib)(结构如式一）是吉利德公司开发的一类plio 5选择性抑 制剂，对pll〇a、0、S和y抑制活性分别为IC50 = 820、565、89和2. 5nM，其pll〇a对 于其它亚型的选择性在40-300倍之间。它对很多恶性血液疾病比如复发的或者难治愈的 慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤以及多发性骨髓瘤在临床上都有 很好的效果 [1]。2014年7月23日，美国FDA批准了吉利德研发的Idelalisib(商品名： Zydelig)上市，Idelalisib成为第一个上市的PI3K抑制剂。FDA批准了 Idelalisib的三 个适应症：和利妥昔单抗（Rituxan)联合治疗复发的慢性淋巴细胞白血病（CLL)、作为单药 治疗复发性滤泡B细胞、非霍奇金淋巴瘤（FL)和复发性小淋巴细胞淋巴瘤（SLL)。
[0011] AS-252424(结构如式一）是一类pllOy选择性抑制剂，它表现出对pllOy以外 其它I型PI3K亚型超过300倍的选择性，对pllO a、0S和y抑制活性分别为IC50 = 935、20000、2000和33nM。它对丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶抑制活性低（IC50>10 yM，分 别为78和79 y M)。尽管AS-252424在大鼠中有比较高的清除率（2. 3L/kg*h)和比较短的 口服半衰期（t1/2= lh)，但是在硫胶质引起的腹膜炎小鼠模型中口服给药10mg/kg剂量就 能减少35%的嗜中性粒细胞的聚集[3]。
[0012] PIK_75(结构如式一）是一个pll〇a选择性抑制剂，对pll〇a抑制活性为IC50 =0? 3nm,对其它PI3K亚型亚的选择性在130 - 2800倍。在A373、HeLa、A549、MCF7和 MCF7ADR-res细胞系抗增殖试验中都表现出了低于微摩尔级的活性，并且在HeLa人宫颈癌 移植模型试验中也有效 [15]。
[0013] 丁61〇〇-115(结构如式一）是一类选择性的口11〇8和丫抑制剂，它对口11〇(1、0、 S和 y抑制活性分别为IC50 = 1300、1200、83和235nM。最显著的是它的选择性，它在 lyM浓度下对其它136种蛋白激酶的抑制率都在50%以下[3]。在血管内皮生长因子和血 小板活化因子参与的心肌梗塞中表现出了很好的抑制水肿和炎症的活性；在缺血性脑伤发 生后对组织存活有一个非常重要的促内皮细胞有丝分裂过程，TG100-115对这个过程没有 中断作用；已经有报道心肌梗赛动物模型中它在保护心脏和减小梗塞方面极其有效 [4]。
[0014] 三、Pm/mTOR双重抑制剂
[0015] 咪唑喹唑啉类化合物NVP-BEZ235 (结构如式一）是PI3K/mT0R双重抑制剂，它对 pllO a、0S和y以及mTOR抑制活性分别为IC50 = 4、75、7和5nM以及20. 7nm。这个 化合物能够通过将细胞周期阻滞在G1期而有效地阻断过于活跃的的PI3K信号，而且它有 很好的耐受性。另外，NVP-BEZ235也能抑制pllOa的致癌突变（E545K和H1047R)引起的 PI3K/mT0R通路的异常激活。它在和传统的细胞毒剂多柔比星和长春新碱联合用药评价其 有效性实验中显示出了非常有前景的效果，它用于治疗高级实体瘤和乳腺癌已经处在临床 评价阶段 [1]。
[0016] XL-765(结构如式一）是一个活性在低纳摩尔水平上的PI3K/mT0R双重抑制剂，它 对pllOa、0S和 y以及mTOR抑制活性分别为IC50 = 39、113、9和43nM以及157nm。 在最近的研究中发现XL-765和诱导自噬药物联合用药能够增加其在胰腺癌中的抗肿瘤活 性。XL-765和化疗药物合用已经在临床试验阶段，数据显示病人的终末半衰期在2-15小时 之间存在病人间差异性 [13]。在小鼠的前列腺癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等多种人癌细胞移 植模型中都观察到了肿瘤生长的停止或者收缩。在单独用药治疗实体瘤的临床一期实验数 据显示，在83名病人中有12名病人病情稳定16周或者更多；7名病人病情稳定24周或者 更多。其观察到最频繁的的毒副作用是肝脏酶活性增高、皮疹和胃肠道不适 [16]。
[0017] ⑶C-0980 (结构如式一）是吗啡啉衍生物其做为一种PI3K/mT0R双重抑制剂正处 于二期临床研究阶段，它是通过取代GDC-0941上的吲唑环为2-氨基嘧啶合成而来的，这种 取代增加了 mTOR的抑制活性。GDC-0980对前列腺癌、乳腺癌和肺癌等多种癌细胞系都表 现出了很好的活性，但是它对黑色素瘤和胰腺癌活性比较低，这可能跟在这两种肿瘤中是 以KRAS和BRAF耐药标记有关。它在PC3和MCF-7 neo/HER2细胞移植模型中都显示出了 有效抑制作用[13]。
[0018] 惠氏发现了一系列三唑嘧啶类化合物，其中PKI_402(结构如式一）是一个 口110<1/1111'01?的双重抑制剂，对口110€[和1111'01?抑制活性分别为1050 = 1.411]\1和1.711]\1。在 体外细胞实验中PKI-402能够引起细胞凋亡并且显示了很高的抗增殖活性，在很多的肿瘤 移植模型中都有抗肿瘤效果 [1]。在MDA-MB-361细胞系中研究PKI-402产生抑制效果的机 制发现其能在体内和体外抑制Akt Ser473和Thr308的磷酸化，也能抑制Akt下游祀分子 的磷酸化；PKI-402MDA-MB-361细胞系凋亡依赖caspase-3通道 [13]。
[0019] 辉瑞公开的PF-04691502 (结构如式一）是一种pllO a /mTOR的双重抑制剂其对 口110<1和1111'01?抑制活性分别为1050 = 0.5711]\1和1611]\1，在口110<1突变的31(0￥3卵巢癌体 内移植模型实验中有很高的有效性，PF-04691502用于治疗实体瘤已经进入临床试验阶段
[1] 〇 ?
[0020] 式一 PI3K抑制剂结构
[0021]
[0022] 参考文献：
[0023] [1]E. Ciraolo, F. Morello and E. Hirsch. Present and Future of PI3K Pathway Inhibition in Cancer:Perspectives and Limitations[J]?Current Medicinal Chemistry，2011，18, 2674-2685.
[0024] [2]Matthew T. Burger, Mark Knapp, Allan ffagman, et al. Synthesis and in Vitro and in Vivo Evaluation of Phosphoinositide-3-kinase Inhibitors[J]. ACS Med. Chem. Lett. 2011，2, 34 - 38.
[0025] [3]Michael K. Ameriks, Jennifer D. Venable. Small Molecule Inhibitors of Phosphoinositide 3-Kinase(PI3K) Sandy [J].Current Topics in Medicinal Chemistry，2009, 9, 738-753.
[0026] [4]Amancio Carnero. Novel inhibitors of the PI3K family[J]. Expert Opin. Investig. Drugs (2009) 18 (9) : 1265-1277.
[0027] [5]Fiona M. Foster, Colin J. Traer, S i emon M. Abraham et al. The phosphoinositide(PI)3-kinase family [J]. Journal of Cell Science，2003, 116, 3037-3040.
[0028] [6]ffilliams R, Berndt A, Miller S, et al. Form and flexibility in phosphoinositide 3-kinases[J]. Biochem Soc Trans. 2009 ；37:615 - 626.
[0029] [7]Peng ffu, Yongzhou Hu. Small molecules targeting phosphoinositide 3-kinases [J]. Med. Chem. Commun. 2012, 3, 1337 - 1355.
[0030] [8] Jaclyn LoPiccolo, Gideon M. Blumenthal, Wendy B. Bernstein, et al.Targeting the PI3K/Akt/mT0R pathway:Effective combinations and clinical considerations[J]. Drug Resistance Updates,2008, 11:32 - 50.
[0031] [9] Tom Crabbe 1, Melanie J We lham，Stephen G Ward. The PI3K inhibitor arsenal:choose your weapon ! [J]. RENDS in Biochemical Sciences，2007, 32:450 - 456.
[0032] [ 1 0] Jo-Anne Pinson, Zhaohua Zheng, Michelle S. Miller, et al. L-Aminoacyl-triazine Derivatives Are Isoform-Selective PI3K旦 inhibitors That Target Nonconserved Asp862of PI3K0 [J].ACS Med. Chem. Lett. 2013, 4:206 - 210.
[0033] [ll]Timothy A Yap, Michelle D Garrett, Mike I Walton, et al. Targeting the PI3K - AKT - mTOR pathway:progress, pitfalls,and promises[J]. Current Opinion in Pharmacology 2008,8:393 - 412.
[0034] [12]Bing-Hua Jiang, Ling-Zhi Liu. PI3K/PTEN Signaling in Angiogenesis and Tumorigenesis [J]. Adv Cancer Res. 2009, 102:19 - 65.
[0035] [13]Ipsita PAL，Mahitosh MANDAL. PI3K and Akt as molecular targets for cancer therapy:current clinical outcomes[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2012(9) :1-18.
[0036] [14] Jorge J Cast i 1 lo, Meera iyengar, Benjamin Kuri tzky, et al. Isotype-specifc inhibition of the
[0037] phosphatidyl inositol-3-kinase pathway in hematologic malignancies[J]. OncoTargets and Therapy 2014 (7):333 - 342.
[0038] [15]Teather J. Sundstrom, Amy C. Anderson and Dennis L. Wright. Inhibitors of phosphoinositide-3-kinase:a structure-based approach to understanding potency and selectivity [J]. Org. Biomol. Chem. , 2009, 7, 840 - 850.
[0039] [16]Ben Markmanl，Rodrigo Dienstmann，Josep Tabernero. Targeting the PI3K/Akt/mT0R Pathway - BeyondRapalogs[J]. Oncotarget, 2010 ；1:530 - 543.

【发明内容】

[0040] 本发明的目的是提供嘧啶衍生物、PI3K抑制剂、药物组合物及其在抗肿瘤药物中 的应用。
[0041] 本发明是这样实现的：
[0042] 式（I )所示的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐，
[0043]
[0044] 其中，
[0045] &为氢，以C i+Ce为取代基的可选取代的芳基，可选取代的C i+Ce直链、支链或环 状烷基，酰二胺基，以卤素、以可选取代的仏一(：6直链、支链、环状烷基为取代基的芳基，以 可选取代的仏一(：6直链、支链、或环状烷基为取代基的吡啶基，以可选取代的C 直链、 支链、或环状烷基为取代基的砜基，以可选取代的(^一(:6直链、支链或环状烷基为取代基的 磺酰基，以可选取代的(^一(:6直链、支链或环状烷基、吡啶基、卤代苯基、胺基、腈基、卤代烷 基为取代基的羰基，可选取代的(^一(: 6直链、支链或环状醇基，酯基，醚基或羧基；
[0046] R2为氢，
NHR2' 或 NHC0NHR3;
[0047] 其中，所述&。为H或可选取代的C 直链、支链或环状烷基；所述R 2'为H或 以(；一(：6直链、支链烷基、C 3-(：6环烷基为取代基的可选取代的酰胺基，以可选取代的C :一 C6直链、支链或环状烷基为取代基的三取代胺基，以一个、两个或三个卤原子为取代基的 可选取代的(；一(： 6直链、支链或环状烷基，C 直链或支链烷氧基，可选取代的C 1一(：6直 链、支链或环状醇基，哌嗪基吡啶基，胺基吡啶基，哌嗪基芳基或卤素为取代基的芳基；其中 哌嗪基和胺基为以可选取代的(^一(：6直链、支链或环状烷基为取代基的取代哌嗪基和取代 胺基；所述R 3 =可选取代的C 直链、支链或环状烷基以及可选取代的芳基；
[0048] R。为氢、羟基或可选取代的C1 一C6直链、支链或环状醇基。
[0049] 本发明中，式（I)所示的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐， 其中，
[0050] (1)当& =可选取代的芳基，R2= H时，RQ = -OH或RQ'0H，其中，R。'为可选取代 的(；一(：6直链、支链或环状烷基；
[0051] 当札=可选取代的芳基，R〇= H时：
或NHR2'，其中，Ri。为H或可选取 代的(；一(：6直链、支链、或环状烷基；R2' = H或C0NHR3;其中，R3= H，C 直链、支链烷 基，环烷基，以C 直链或支链烷基为取代基的三取代胺基，一卤代C 直链、 支链或环状烷基，二卤代(；一(：6直链、支链或环状烷基、三卤代C 直链、支链或环状烷 基，
H8，R90H 或

[0052] 其中，
[0053] 当X = N时，所述R4= 或NHR6,其中，R 5、R6独立地为C厂(：6直链或支链 烷基；
[0054] 当 x = C 时，所述 R4=H 、卤素，其中，R7 = H、Ci-C6烷基、B0C 或-
[0055] 所述Rs为可选取代的C「C6直链、支链或环状烷基；
[0056] 所述R9为可选取代的C「C6直链、支链或环状烷基；
[0057] (2)当 R〇= H，R := NHC0NHR/ 时，R2= CONHR n，所述 R3'、Rn各自独立地为 H、可 选取代的(；一(：6直链、支链、或环状烷基；
[0058] (3)当RQ= H，R H或C :―C6直链、支链烷基时；R 2= NHC0NHR 3, R3为可选取代 的(；一(：6直链、支链或环状烷基；
[0059] (4)当私=札1?2=见10)见^3，且1?3为可选取代的(： 1一(：6直链、支链或环状烷基时，
[0060] 其中，
[0061] 所述Rn、R2。、R21各自独立地为H或可选取代的C 直链、支链或环状烷基；
[0062] 所述 Rl2、Rl3、Rl4a、尺16、Rl8a、尺23、尺24、尺26、尺27、尺28、尺29、尺3。、尺31、尺32、尺33、尺34、各自独^?地 为可选取代的(；一(： 6直链、支链或环状烷基；
[0063] 所述R14为可选取代的C 直链、支链或环状烷基或三卤代C 直链、支链、 或环状烷基；
[0064] 所述R15为可选取代的C 直链、支链、环状烷基或以卤素或C 直链、支链 或环状烷基为取代基的可选取代的芳烃；
[0065] 所述R1S、R19独立地为H、Boc或可选取代的C「C 6直链、支链、环状烷基；
[0066] 所述 Y = F、Cl、Br 或 I ;
[0067] 所述 Z 为 F、Cl、Br、I 或氢；
[0068] 本发明中，嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐，其中，
[0069] (1)当R1 =苄基，R2= H时，R。为羟基、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇； S
[0070] 当札=苄基，R〇= H 时，r2= -A-NHR|。，NHR2' 或 NHC0NHR3;
[0071] 其中，
[0072] 所述&。为H、甲基、乙基、丙基或丁基；
[0073] 所述 R2' = H 或 C0NHR3;
[0074] 所述R3= H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、环丙烷基、二甲基乙基胺、氟代乙基、 二氣代乙基、二氣代乙基、一_〇 _馬或R9OH;
[0075] 其中，当X = N时，所述R4= H、-%或NHR6，其中，R5、R6独立地为甲基、乙基、 丙基或丁基；
[0076] 当 X = C 时，所述 R4= H、或 F，其中，R7 = H、B0C 或-?〇;
[0077] 所述R8为甲基、乙基、丙基或丁基；
[0078] 所述R9为甲基、乙基、丙基或丁基；
[0079] (2)当 RQ= H 时，Ri= NHCONHR/ ;R2= C0NHRn，所述 R3'、Rn各自独立地为甲基， 乙基、丙基、异丙基或丁基；
[0080] (3)当Rc= H时，R1= H、甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基时；R2= NHC0NHR3，R3 = 甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基；
[0081] (4)当RQ= H，R2= NHC0NHR3，R3=甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基时，R1 =
[0082] 所述R1Q、Rn、R2。、R 21各自独立地为H或甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基；
[0083] 所述 R12、Rl3、Rl6、Rl8a、R23、R24、R26、R27、R28、R29、R3。、R3I、R32、R33、R34各自独立地为甲 基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环戊基或环己基；
[0084] 所述R14为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、一氟代(^-(：4直链或支链烷基、二氟代 (；-(： 4直链或支链烷基、三氟代甲基、三氟代乙基、三氟代丙基、三氟代异丙基、三氟代丁基或 三氟代异丁基；
[0085] 所述R15为甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，环戊基，环己基，一氟代C「(： 4直 链、支链、环状烷基，二氟代Q-Q直链、支链、环状烷基，三氟代c i-c4直链、支链、环状烷基， 以氟或(^一匕直链、支链、环状烷基为取代基在对位、邻位、间位取代或未取代的苯基；
[0086] 所述R1S、R19独立地为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或Boc ;
[0087] 所述 Y = F ;
[0088] 所述 Z = F。
[0089] 本发明所述的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐，为以下化合 物之一：
[0090]

[0092] 本发明所述的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐的制备方法， 由化合物1制备而成，所述化合物1的制备方法为：
[0093]
[0094] 本发明的细胞毒性剂，包含所述的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接 受的盐。
[0095] 本发明的药物组合物，包含治疗有效量的所述的的嘧啶衍生物及其多种晶型体或 其药学上可以接受的盐以及药学上可接受的载体。
[0096] 本发明所述的嘧啶衍生物及其多种晶型体或其药学上可以接受的盐在制备细胞 毒性剂以及抗肿瘤药物中的应用。
[0097] 本发明所述的细胞毒性剂在制备针对PI3K激酶异常改变的药物以及抗肿瘤药物 中的应用。
[0098] 本发明所述的药物组合物在制备制备针对PI3K激酶异常改变的药物以及抗肿瘤 药物中的应用。
[0099] 本发明中，化合物1的合成路线如下：
[0100]
[0101] 利用化合物1合成脲衍生物包括以下两个步骤：
[0102]
[0103] 其中脲的合成通法如下：
[0104] 将 GL-1 (94mg，0. 2mmol)溶解在 2mL 无水 DCM 中并加入三乙胺（61mg，0. 6mmol)。 混合物在冰盐浴下冷却，加入三光气（30mg，0. lmmol)，继续在冰盐浴下搅拌15min后，5eq 胺的无水DCM溶液或者胺的盐酸盐和6eq的三乙胺加入到上述反应液中继续反应过夜。反 应中加入水并用DCM萃取，有机相用水和饱和氯化钠洗涤，减压蒸干溶剂，残余物通过柱层 析或者制备薄层色谱纯化得到相应的脲衍生物。
[0105] 哌啶衍生物的合成路线如下：
[0106]
[0107] 利用GL-26制取哌啶衍生物的方式包括如下两种：
[0108] 过程 A
[0109] 将GL-26(100mg，0. 15mmol)悬浮在二氯甲烷中加入1.2eq HATU、相应的酸 (1. leq)和4eq三乙胺，室温下搅拌过夜后，加入饱和碳酸氢钠，DCM萃取。有机相水和饱和 氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物通过柱层析纯化得相应的哌啶衍生物。
[0110] 过程 B
[0111] 将GL-26 (100mg，0. 15mmol)悬浮在无水二氯甲烧中加入3. 6eq三乙胺，冰浴下冷 却至〇°C。然后，将1. leq酸酐或者酰氯的无水二氯甲烷溶液滴加到反应液中，继续搅拌反 应过夜或者TLC监测反应完成后，加入饱和碳酸氢钠，二氯甲烷萃取，有机相用水和饱和氯 化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物通过柱层析纯化得相应的哌啶衍生物。
【附图说明】 图1为试验实施例64的实验流程图。
【具体实施方式】
[0112] 实施例1
[0113] 化合物3-(1-苄基哌啶-4-基）-5-氯-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶（化 合物1)的合成：
[0114] 第一步：
[0115]
[0116] 将N-Boc-4-哌啶甲酸（230mg，lmmol)和CDI (292mg，1. 8mmol)混合于三口瓶中，用 N2排空空气然后加入2mL无水THF，反应液在环境温度下搅拌1-2h后将硝基甲烷（183mg， 3mmol)加到反应体系中再加入DBU(685mg，4. 5mmol)。反应液继续搅拌36h后加入乙酸乙 酯稀释，再加入6mL 2N HC1溶液，乙酸乙酯萃取，有机相用水洗至中性，再用饱和氯化钠 溶液洗三次，无水硫酸钠干燥，减压除去乙酸乙酯得到黄白色产物（130mg，收率96% )，不 用纯化直接投下一步。mp 95-97°C ? 4 NMR(300MHz, CDC13) S 5. 36(s, 2H), 4. 14(d, J = 13 .8Hz, 2H), 2. 86-2. 76 (m, 2H), 2. 64 (tt, J = 11. 4, 3. 9Hz, 1H), 1. 90 - 1. 85 (m, 2H), 1. 68 -1. 55 (m, 2H), 1. 47 (s, 9H). ESI-MS:m/z = 172. 94 [M-Boc+H]+.
[0117] 第二步：
[0118]
[0119] 将化合物 1-1 (452mg，1. 66mmol)和盐酸轻胺（116mg，1. 67mmol)以及 NaHC03(140mg，1. 67mmol)混合并加入8mL乙醇，所得的悬浊液在50°C下反应过夜。TLC监 测反应完成，减压浓缩反应液然后加入水和乙酸乙酯萃取，有机相用水和饱和氯化钠溶液 分别洗三次然后用无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得黄白色产物l-2(454mg，cis/trans = 6/1，收率 95%)，产物不用纯化可直接投下一步。mp 147-149°C/H NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 11. 62 (s, 0. 11H), 11. 48 (s, 0. 71H), 5. 35 (s, 0. 3H), 5. 33 (s, 1. 7H), 3. 97 (d, J = 12. 9Hz, 2 H), 2. 93-2. 59 (m, 2H), 2. 46 (tt, J = 11.7,3. 6Hz, 1H), L 80-1. 760 (m, 1. 75H), 1. 63-1. 60 (m ,0. 34H), 1. 40 (s, 9H), 1. 40-1. 29 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 187. 96 [M-Boc+H]+.
[0120] 第三步：
[0121]
[0122] 将上步所得化合物1-2 (8. 912g，31mmol)溶解在80mL无水乙醚中，缓慢 滴加草酰氯单乙酯（3. 966mL，36mmol)的无水乙醚溶液，然后反应混合物在室温下 搅拌24h，反应液降温，在0 °C下滴加三乙胺（3. 923g，38. 8mmol)。滴完，混合物在 室温下搅拌60h后减压浓缩，加入水和乙酸乙酯萃取，有机相用水和饱和氯化钠各 洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。减压浓缩柱层析得到白色产物1-3(6. 614g，收率 58 % )。mp 59-61。(： ? 4 NMR(300MHz，CDC13) S 4. 52 (q，J = 7. 2Hz，2H)，4. 21 (d，J = 13. 2Hz, 2H), 3. 27 (tt, J = 11.7,3. 6Hz, 1H), 2. 93-2. 85 (m, 2H), 2. 03 - 1. 98 (m, 2H), L 86 -1. 72 (m, 2H), 1. 47 (s, 9H), 1. 43 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 270. 05 [M-Boc+H]+.
[0123] 第四步：
[0124]
[0125] 将上步所制化合物l_3(151mg，0. 41mmol)溶于lmL氨的甲醇溶液并在室温下 搅拌3h。减压蒸干溶剂，残余物用甲醇带2次得到白色产物l-4(134mg，收率96 % )。 mp 184-186 °C ? 4 匪R(300MHz，DMS0-d6) S 8. 70(s，1H)，8. 57(s，1H)，4. 02(d，J = 12. 9Hz, 2H), 3. 38 (tt, J = 11. 7, 3. 3Hz, 1H), 2. 95-2. 86 (m, 2H), 2. 01-1. 96 (m, 2H), 1. 62 - I. 49(m, 2H), 1.41(s, 9H).ESI-MS:m/z = 241. 04[M-Boc+H]+.
[0126] 第五步：
[0127]
[0128] 将上步所制化合物l-4(85mg，0. 25mmol)溶于0. 5mL DCM中，加入1. 5mL TFA并在 室温下搅拌2 h。减压蒸干溶剂，残余物用乙醇带两次以除去残余TFA，得到淡黄色针状晶 体 l-5(89mg，收率 100%)。mp NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.77(brs，2H)，8.7 4(s，1H)，8.61 (s，1H)，3.55 (tt，J = 11.4,3.3Hz，1H)，3. 41-3. 37 (m，2H)，3. 14-3. 07 (m，2H) ,2. 19-2. 14 (m, 2H), 1. 97-1. 83 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 241. 04[M+H]+.
[0129] 第六步：
[0130]
[0131] 将上步所制化合物1-5 (604mg，1. 71mmol)悬浮在乙腈中加入2eq三乙胺在室温 下搅拌2h进行解离。乙腈减压蒸干残余物用乙腈带两次以除去残余三乙胺。残余物加入 5mL无水乙腈和DIPEA(441mg，3. 41mmol)并且降温至0°C，缓慢滴加溴苄（292mg，1. 71mmol) 的无水乙腈溶液。滴完在室温下搅拌反应，TLC和LC-MS监测反应完成后减压浓缩，然后 加入氯仿和饱和碳酸钠溶液，氯仿萃取。有机相柱层析纯化得到淡黄色固体1-6 (456mg， 收率81%)。11^ 134-136。(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)58.70(8，111)，8.57(8，111)，7.36-7.22(m,5H),3.52(s,2H),3. 16(tt,J = 11.4, 3. 3Hz, 1H) , 2. 91 (d, J = II. 7Hz, 2H), 2. 09 (t, J = 11. 7Hz, 2H), 1. 99-1. 95 (m, 2H), 1. 79-1. 65 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 331. 08[M+H]+.
[0132] 第七步：
[0133]
[0134] 将上步所制化合物1-6 (73mg，0? 22mmol)悬浮在2mL混合溶剂（乙醇：水 =2:1)中并且冷却至0°C。然后加入氯化铵（296mg，5. 53mmol)，分批缓慢加入锌 粉（145mg，2. 22mmol)，室温下搅拌4h。抽滤除去不溶物，滤液蒸干柱层析纯化得 至丨J 淡黄色固体 l_7(52mg，收率 78 % )。mp 189-191 °C "H NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 7. 69 (s, 2H), 7. 36 (s, 1H), 7. 36 - 7. 21 (m, 5H), 5. 16 (s, 2H), 3. 50 (s, 2H), 2. 89-2. 65 (m, 2H ),2. 75(tt, J = 11.7, 3. 6Hz, 1H), 2. 10-2. 01 (m, 2H), 1. 92-1. 87 (m, 2H), 1. 72-1. 58 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 301. 08[M+H]+.
[0135] 第八步：
[0136]
[0137] 将上步所制化合物1-7 (60mg，0. 2mmol)溶解在2mL无水THF中，加入三光 气（30mg，0. lmmol)，升温回流lh。反应混合物降温至室温，抽滤收集白色沉淀物并 用乙酸乙酯或者DCM洗涤得目标化合物1-8 (66mg，收率90 % )。mp 142-144 °C . 4 NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 11. 67 (s, 2H), 11. 61 (s, 1H), 10. 99 (s, 1H), 7. 67-7. 64 (m, 2H), 7. 49 - 7. 47 (m, 3H), 4. 35 (d, J = 3. 9Hz, 2H), 3. 46 (d, J = 11. 7Hz, 2H), 3. 23-3. 12 (m, 1H )，3. 03-2. 92 (m, 2H)，2. 30-2. 04 (m, 4H) ? ESI-MS: m/z = 327. 11 [M+H]+.
[0138] 第九步：
[0139]
[0140] 将上步所得化合物l-8(236mg，0. 62mmol)和6mL三氯氧磷的混合物升温回流反 应24h，然后减压浓缩至干，残余物倒到碎冰中淬灭。水相用6N NaOH水溶液调pH = 8-9， 加入乙酸乙酯萃取。有机相用水洗至中性，饱和氯化钠洗三次，无水硫酸钠干燥然后减 压蒸干溶剂，残余物溶解在8mL DCM中并用冰盐浴降温，然后加入TEA(90mg，0. 89mmol)。 将吗啡啉（55mg，0. 63mmol)的DCM溶液滴加到上述溶液中并继续搅拌lOmin。TLC反应 完全后加入水，然后用DCM萃取有机相用水和饱和氯化钠洗涤，蒸干溶剂柱层析得到淡 黄色固体化合物 l(167mg，收率62%)。11^ 168-170°(：.111匪1?(30011抱，0)(：13)57.37-7. 23 (m, 5H), 4. 21 - 3. 95 (m, 4H), 3. 84 (t, J = 5. 1Hz, 4H), 3. 57 (s, 2H), 3. 17-3. 07 (m, 1H), 3 .02-2. 98 (m, 2H), 2. 23 - 1. 98 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 414. 18 [M+H]+.
[0141] 实施例2
[0142] 利用化合物1通过Suzuki偶联反应制备如下所示的啼啶衍生物4-(3-(1-苄基哌 啶-4-基）-7_吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯胺（GL-1):
[0143]
[0144] 将化合物1 (414mg，lmmol)、对氨基苯硼酸频哪醇酯（329mg，1. 5mmol)、 Pd(Pcy3)2Cl2(37mg，0. 05mmol)和 CsF(456mg，3mmol)放在三 口瓶中，三 口瓶排空空气再充 入Ar气，重复进行三次，然后将12mL溶剂（NMP:水=9:1)注射到三口瓶中。反应混合 物在Ar气保护下100°C下反应48h后，加入水稀释并用乙酸乙酯萃取，有机相用水和饱和 氯化钠洗涤，减压浓缩，残余物通过柱层析得黄色固体化合物GL-1 (160mg，产率34% )。 mp 118-119 6. 70 (m，2H)，4. 14-4. 11 (m，4H)，3. 88 - 3. 85 (m，6H)，3. 63 (s，2H)，3. 30-3. 13 (m，1H)，3. 07-3 .03 (m, 2H), 2. 42-2. 09 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 471. 28[M+H]+.
[0145] 实施例3
[0146] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-2)
[0147]
[0148] 按上述反应式，GL-2是用相应胺的盐酸盐通过脲的合成通法合成的黄色固体 (52mg，收率 49 % )。mp 147-149 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 79 (s, 1H), 8. 23 (d, J =8. 7Hz, 2H), 7. 52(d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 25 (m, 5H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H) ,4. 05-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 17-3. 09 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04 - 1. 92 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 528. 38 [M+H]+.
[0149] 实施例4
[0150] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-乙脲（GL-3)
[0151]
[0152] 按上述反应式，GL-3是用相应胺的盐酸盐通过脲的合成通法合成的黄色固体 (53mg，收率49% )。mpl40-14rC ? 4 NMR(300MHz, DMS0-d6) S 8. 70 (s, 1H)，8. 24-8. 20 (m, 2H ),7. 52-7. 48 (m, 2H), 7. 35 - 7. 22 (m, 5H), 6. 17 (t, J = 5. 5Hz, 1H), 4. 05-4. 02 (m, 4H), 3. 80 - 3. 77 (m, 4H), 3. 53 (s, 2H), 3. 17-3. 08 (m, 3H), 2. 94-2. 90 (m, 2H), 2. 22-2. 09 (m, 4H), 2. 04-1. 90 (m, 2H), 1. 06 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 542. 39[M+H]+.
[0153] 实施例5
[0154] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-4)
[0155]
[0156] 按上述反应式，GL-4是用氨的甲醇溶液通过脲的合成通法合成 的黄色固体（46mg，收率 50 % )。mp204-206 °C NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 8. 80 (s, 1H) ,8.25 - 8. 22 (m, 2H), 7. 54-7. 50 (m, 2H) ,7.35 - 7. 23 (m, 5H), 5. 94 (s, 2H ),4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. 10 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 23-2. 10(m, 4H), 2. 03- 1.91(m, 2H). ESI-MS:m/z = 514. 39[M+H]+.
[0157] 实施例6
[0158] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2-(二甲氨基）乙基）脲（GL-5)
[0159]
[0160] 按上述反应式，GL-5是用相应的胺通过脲的合成通法合成的 黄色固体（70mg，收率 67 % )。mp 96-98 °C . 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 8. 94 (s, 1H) , 8. 23 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 50 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 19 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2 H),3. 20(q, J = 6.0Hz,2H), 3. 15-3. 08 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 1Hz, 2H), 2. 36 (t, J =6. 0Hz, 2H), 2. 20 (s, 6H), 2. 20-2. 10 (m, 4H), 2. 04 - 1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 585. 62[M+H]+.
[0161] 实施例7
[0162] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-异丙基脲（GL-6)
[0163]
[0164] 按上述反应式，GL-6是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（41mg， 收率 37 % )。mp 205-206 °C ? 4 NMR (300MHz, DMS0-d6) 58.56 (s，lH), 8.23 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 49 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 07 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 4. 06-4 .03(m, 4H), 3. 81-3. 74(m, 5H), 3. 54(s, 2H), 3. 14(tt, J = 11. 1, 4. 2Hz, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 22 - 2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H), 1. 11 (d, J = 6. 6Hz, 6H). ESI-MS:m/z = 556. 38 [M+H]+.
[0165] 实施例8
[0166] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_环丙基脲（GL-7)
[0167]
[0168] 按上述反应式，GL-7是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（46mg， 收率 42 % )。mp 220-221 °C ? 4 NMR (300MHz, DMS0-d6) 58.58 (s，lH), 8.23 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 52 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 24 (m, 5H), 6. 45 (d, J = 2. 7Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. 10 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 10. 5Hz, 2H), 2. 60-2. 53 (m, 1H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H), 0. 68 - 0. 62 (m, 2H), 0. 44 - 0. 39 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 554. 43 [M+H]+.
[0169] 实施例9
[0170] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1- (4- (3- (1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2-氟乙基）脲（GL-8)
[0171]
[0172] 按上述反应式，GL-8是用相应胺的盐酸盐通过脲的合成通法合成的黄色固体 (47mg，收率 42 % )。mpll5-117°C "H NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.84(s，lH)，8.24(d，J = 9. 0Hz, 2H), 7. 52 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 45 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 56 (t, J =4. 8Hz, 1H), 4. 40 (t, J = 5. 1Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H),3. 47(q, J = 5. 4Hz, 1H), 3. 38 (q, J = 5. 4Hz, 1H), 3. 19-3. 09 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 1Hz, 2H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04 - 1. 92 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 560. 38 [M+H]+.
[0173] 实施例10
[0174] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1- (4- (3- (1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(6-(4-甲基哌嗪-1-基）吡啶-3-基）脲（GL-9)
[0175]
[0176] GL-9是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（43mg，收率30%)。 mp 144-145 °C ? 4 匪R (300MHz，DMS0-d6) 5 9.00 (s，lH)，8.54 (s，lH)，8. 30-8. 26 (m，2 H), 8. 16 (d, J = 3. 0Hz, 1H) ,7.71 (dd, J = 9. 0, 2. 7Hz, 1H), 7. 58-7. 53 (m, 2H), 7. 36 -7. 25 (m, 5H), 6. 83 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 79 (m, 4H), 3. 56 (s, 2H), 3. 43 - 3. 40 (m, 4H), 3. 20-3. 12 (m, 1H), 2. 97-2. 93 (m, 2H), 2. 48-2. 45 (m, 4H), 2. 26 (s, 3 H),2. 26-2. 12(m, 4H), 2. 05-1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 689. 78[M+H]+.
[0177] 实施例11
[0178] 利用GL-1制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶_5_基）苯基）_3_ (4- ((2-(二甲胺基）乙基）（甲基）氨基）苯基）脈（GL-10)
[0179]
[0180] 将 #-(2-(二甲胺基）乙基甲基-1,4-苯二胺（116mg，0.6mmol)溶解 在4mL无水DCM中并加入三乙胺（182mg，1. 8mmol)，所得混合物冰盐浴下冷却。将三光 气（89mg，0. 3mmol)的无水DCM溶液滴加到反应液中并继续在冰盐浴下搅拌15min。然 后将GL-1 (94mg，0. 2mmol)的无水DCM溶液滴加到上述反应液中并搅拌过夜后，加入水， DCM萃取，有机相用水和饱和氯化钠洗涤，减压浓缩，残余物通过柱层析和制备薄层色 谱纯化得黄色固体 GL-10 (50mg，收率 36 % )。mp 134-135 °C ? 4 NMR(300MHz, DMS0-d6) 8 8. 81 (s, 1H), 8. 33 (s, 1H), 8. 27 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 56 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 -7. 24 (m, 7H), 6. 66 (d, J = 9. 3Hz, 2H), 4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2 H), 3. 37 (t, J = 7. 2Hz, 2H), 3. 18-3. 11 (m, 1H), 2. 95-2. 91 (m, 2H), 2. 86 (s, 3H), 2. 38 ( t, J = 7. 2Hz, 2H),2, 23-2. ll(m, 4H),2. 20(s, 6H),2. 05 - 1.93 (m, 2H).ESI-MS:m/z = 690. 54 [M+H]+.
[0181] 实施例12
[0182] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(6-(甲氨基）吡啶-3-基）脲（GL-11)
[0183]
[0184] 按上述反应式，GL-11是用相应的胺通过脲的合成通法合成的红色固体（69mg，收 率 56% )。mpl49-15(TC ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 91 (s，1H)，8. 29-8. 25 (m，3H)，8. 00 (d ,J = 3. 0Hz, 1H), 7. 58 - 7. 50 (m, 3H), 7. 36 - 7. 25 (m, 5H), 6. 43 (d, J = 8. 4Hz, 1H), 6. 24 (q, J =4. 8Hz, 1H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 55 (s, 2H), 3. 19-3. 10 (m, 1H), 2. 96-2. 92 (m, 2H), 2. 74 (d, J = 5. 1Hz, 3H), 2. 23-2. 11 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 620. 55[M+H]+.
[0185] 实施例13
[0186] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(吡啶-3-基）脲（GL-12)
[0187]
[0188] 按上述反应式，GL-12是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（43mg，收 率 36% )。mp212-213°C ? NMR(300MHz，DMS0-d6) S 9. 14(s，1H)，8. 97(s，1H)，8. 62(d，J = 2. 4Hz，1H)，8. 32-8. 28 (m，2H)，8. 21 (dd，J = 4. 8, 1. 5Hz，1H)，7. 99-7. 95 (m，1H)，7. 61-7. 57 (m，2H)，7. 36 - 7. 27 (m，6H)，4. 07-4. 04 (m，4H)，3. 82-3. 79 (m，4H)，3. 56 (s，2H)，3. 25-3. 08 ( m, 1H), 3. 03-2. 82 (m, 2H), 2. 16-1. 98 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 591. 58[M+H]+.
[0189] 实施例14
[0190] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲氧基脲（GL-13)
[0191]
[0192] 按上述反应式，GL-13是用相应胺的盐酸盐通过脲的合成通法合 成的黄色固体（52mg，收率 48 % )。mpl54-155 °C NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 9. 61 (s, 1H), 9. 09 (s, 1H), 8. 27 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 73 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 35 -7. 23 (m, 5H), 4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 65 (s, 3H), 3. 54 (s, 2H), 3. 20-3. 11 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 10. 8Hz, 2H), 2. 23-2. 11 (m, 4H), 2. 04 - 1. 93 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 544. 33 [M+H]+.
[0193] 实施例15
[0194] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2_羟乙基）脲（GL-14)
[0195]
[0196] 按上述反应式，GL-14是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（76mg，收 率 68 % )。mpl27-129。(： ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 83 (s，1H)，8. 26-8. 21 (m，2H)，7. 52 -7. 48 (m, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 27 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 76 (t, J = 5. 4Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 46 (q, J = 5. 7Hz, 2H), 3. 18 (q, J = 5. 4Hz, 2H), 3. 15 - 3. 10 (m, 1H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 93 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 558. 40[M+H]+.
[0197] 实施例16
[0198] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_苯脲（GL-15)
[0199]
[0200] 按上述反应式，GL-15是用相应的胺通过脲的合成通法合成的白色固体（61mg，收 率 52% )。11^201-202。(： "H NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.94(s，lH)，8.72(s，1H)，8.31_8.28( m, 2H), 7. 60-7. 57 (m, 2H), 7. 49-7. 46 (m, 2H), 7. 36 - 7. 23 (m, 7H), 6. 99 (t, J = 7. 5Hz, 1H), 4 .07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. ll(m, 1H), 2. 95-2. 91 (m, 2H), 2. 2 2-2. ll(m, 4H),2. 05 - 1.92(m, 2H). ESI-MS:m/z = 590. 48[M+H]+.
[0201] 实施例17
[0202] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1- (4- (3- (1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(4-(4-甲基哌嗪-1-基）苯基）脲（GL-16)
[0203]
[0204] 按上述反应式，GL-16是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（95mg，收 率 69% )。mp216-218°C ? NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 84(s，1H)，8. 45(s，1H)，8. 28(d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 56 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 24 (m, 7H), 6. 89 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 4. 07-4. 04 (m，4H)，3. 81-3. 79 (m，4H)，3. 54 (s，2H)，3. 19-3. 11 (m，1H)，3. 07 - 3. 04 (m，4H)，2. 93 (d，J =11. 1Hz, 2H), 2. 47 - 2. 44 (m, 4H), 2. 22 (s, 3H), 2. 22 - 2. 11 (m, 4H), 2. 04-1. 93 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 688. 44[M+H]+.
[0205] 实施例18
[0206] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1- (4- (3- (1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(4-(吡咯烷-1-基）苯基）脲（GL-17)
[0207]
[0208] 按上述反应式，GL-17是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体 (70mg，收率 53 % )。mp221-223。(： NMR(300MHz，DMS0-d6) S8.79(s，lH)，8.30(s， 1H)，8. 29-8. 25 (m，2H)，7. 57-7. 54 (m，2H)，7. 36-7. 23 (m，7H)，6. 50 (d，J = 9. 3Hz，2H ),4. 06-4. 04 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 21-3. 11 (m, 5H), 2. 93 (d, J = 11. 4Hz, 2H), 2. 23-2. ll(m, 4H), 2. 04 - 1.92(m, 6H). ESI-MS:m/z = 659. 44[M+H]+.
[0209] 实施例19
[0210] 利用GL-1制备4-(4-(3-(4-(3-(l-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）脲基）苯基）哌嗪-1-甲酸叔丁酯（GL-18)
[0211]
[0212] GL-18是用相应的胺通过和GL-10相同方法合成的黄色固体（78mg，收率 50 % )。mp 156-158。(： ? 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) S 8. 86 (s，1H)，8. 49 (s，1H)，8. 28 (d，J = 9. 0Hz, 2H), 7. 58 (d, J = 9. 0Hz, 2H), 7. 36 - 7. 25 (m, 7H), 6. 92 (d, J = 9. 3Hz, 2H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 55 (s, 2H), 3. 47-3. 44 (m, 4H), 3. 19-3. 10 (m, 1H), 3. 03-2. 99 (m ,4H), 2. 96-2. 92 (m, 2H), 2. 23 - 2. 12 (m, 4H), 2. 05-1. 94 (m, 2H), 1. 42 (s, 9H). ESI-MS:m/z = 774. 58 [M+H]+.
[0213] 实施例20
[0214] 利用GL-18制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并 嘧啶-5-基）苯基）-3- (4-(哌嗪-1-基）苯基）脲（GL-19)
[0215]
[0216] 将 GL-18(45mg，0. 058mmol)溶解在 0. 5mL DCM 中，然后加入 2mL TFA，室温下 搅拌反应2h。减压蒸干溶剂，加入乙醇再减压蒸干，残余物加入DCM和6N NaOH水溶 液并萃取。有机相减压浓缩通过柱层析和制备薄层色谱纯化得黄色固体（19mg，收率 49 % )。mp 156-158。(： ? 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) S 9. 04 (s，1H)，8. 67 (s，1H)，8. 27 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 57 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 7H), 6. 88 (d, J = 9. 3Hz, 2H), 5. 52 -4. 31 (brs, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 19-3. 09 (m, 1H), 3. 0 5-3. 02 (m, 4H), 2. 94 - 2. 91 (m, 6H), 2. 22-2. 10 (m, 4H), 2. 03 - 1. 93 (m, 2H). ESI-MS :m/z = 674. 51[M+H]+.
[0217] 实施例21
[0218] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(4_氟苯基）脲（GL-20)
[0219]
[0220] GL-20是用相应的胺通过脲的合成通法合成的黄色固体（68mg，收率45% )。 8. 7Hz, 2H), 7. 58 (d, J = 8. 7Hz, 2H) ,7.52 - 7. 45 (m, 2H), 7. 36 - 7. 23 (m, 5H) ,7.18-7. 10 (m, 2H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 18-3. 11 (m, 1H), 2. 95-2. 92 (m, 2H),2. 23-2. ll(m, 4H), 2. 04 - 1.93(m, 2H). ESI-MS :m/z = 608. 38[M+H]+.
[0221] 实施例22
[0222] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1- (4- (3- (1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2, 2, 2-三氟乙基）脲（GL-21)
[0223]
[0224] GL-21是用相应胺的盐酸盐通过脲的合成通法合成的白色固体（81mg， 收率 54 % )。mp 197-198 °C /HNMR (300MHz, DMS0-d6) 59.02 (s，lH), 8. 28-8. 24 (m, 2H), 7. 56-7. 51 (m, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 6. 80 (t, J = 6. 6Hz, 1H), 4. 06 -4. 03 (m, 4H), 3. 99-3. 90 (m, 2H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 19-3. 09 (m, 1H), 2. 93 (d ,J = 11. 1Hz, 2H), 2. 10-2. 22 (m, 4H), 2. 05 - 1. 93 (m, 2H). ESI-MS :m/z = 596. 35[M+H]+.
[0225] 实施例23
[0226] 利用GL-1通过脲的合成通法制备1- (4- (3- (1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-(2, 2-二氟乙基）脲（GL-22)
[0227]
[0228] GL-22是用相应的胺通过脲的合成通法合成的白色固体（68mg，收率49% )。 mp 185-186 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 97 (s, 1H), 8. 25 (d, J = 9Hz, 2H), 7. 52 (d, J =8. 7Hz, 2H), 7. 42 - 7. 16 (m, 5H), 6. 55 (t, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 27-5. 88 (m, 1H), 4. 05 -4. 03 (m, 1H), 3. 81 - 3. 78 (m, 1H), 3. 62-3. 48 (m, 4H), 3. 18-3. 10 (m, 1H), 2. 95-2. 91 (m, 2H), 2. 10 - 2. 22 (m, 4H), 2. 04 - 1. 19 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 578. 39[M+H]+.
[0229] 实施例24
[0230] 利用GL-1通过制备N-异丙基-4- (5- (4- (3-异丙脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-甲酰胺（GL-23)
[0231]
[0232] 将 GL-l(80mg，0. 17mmol)溶解在 2mL 无水 DCM 中并加入三乙胺（52mg，0. 51mmol)， 混合物在冰浴下冷却。然后加入三光气（31mg，0. lmmol)，继续在冰浴下搅拌反应15min。 1-甲基乙胺（50mg，0.85mmol)的无水DCM溶液加到上述反应液中并搅拌过夜。加入 水，DCM萃取，有机相减压浓缩，粗品通过柱层析和制备薄层色谱纯化得黄色固体（41mg， 收率 44 % )。mp 223-225 °C NMR (300MHz，DMS0-d6) 58.59 (s，lH)，8.23 (d，J = 8. 7Hz, 2H), 7. 48 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 25 (d, J = 7. 8Hz, 1H), 6. 08 (d, J = 7. 8Hz, 1H), 4. 09-4. 05 (m, 6H), 3. 81-3. 74 (m, 6H), 3. 37-3. 31 (m, 1H), 2. 91 (t, J = 10. 8Hz, 2H), 2. 04-1. 83 (m, 4H), 1. ll(d, J = 3. 6Hz, 6H), 1.09(d, J = 3. 6Hz, 6H). ESI-MS:m/z = 551. 46 [M+H]+.
[0233] 实施例25
[0234] N-甲基-4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基） 哌啶-1-甲酰胺（GL-24)的制备
[0235]
[0236] GL-24是从GL-2的合成过程中分离得到的副产物。mp 174-176 °C . 4 NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 80 (s, 1H) , 8. 23 (d, J = 8. 7Hz, 2H) , 7. 51 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 49 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 6. 09 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06-4. 0 (m, 6H), 3. 81-3. 78 (m, 4H), 3. 40-3. 32 (m, 1H), 2. 94 (t, J = 11. 7Hz, 2H), 2. 64 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 62 (d, J = 4. 2Hz, 3H), 2. 07-2. 02 (m, 2H), 1. 94-1. 80 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 495. 4 [M+H]+.
[0237] 实施例26
[0238] 利用GL-1制备1-(4-(3-(1_苄基哌啶-4-基）-7_吗啡啉基异噁唑[4,5_d]并嘧 啶-5-基）苯基）-3-甲基硫脲（GL-25)
[0239]
[0240] 将GL-1 (141mg，0. 3mmol)溶解在3mL无水二氧六环中，加入甲基异硫氰酸酯 (24mg，0. 33mmol)回流反应18h。补加甲基异硫氰酸酯（llmg，0. 15mmol)继续回流反应24h。 反应液浓缩至干加入水和DCM萃取。有机相用水和饱和氯化钠洗，减压浓缩，残余物通过柱 层析和薄层色谱纯化后再用乙醚洗涤产品得黄色固体（44mg，收率30% ) mp 175-177°C . 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) S 9. 78 (s，1H)，8. 30 (d，J = 8. 7Hz，2H)，7. 84 (s，1H)，7. 55 (d，J = 8. 4Hz, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 4. 06 - 4. 02 (m, 4H), 3. 81-3. 80 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 20 -3. 10(m, 1H),2. 95-2. 91 (m, 5H), 2. 22 - 1.94(m, 6H). ESI-MS:m/z = 544. 34[M+H]+.
[0241] 实施例27
[0242] 4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌 啶-1-甲酸叔丁酯（GL-37)和1-甲基-3- (4- (7-吗啡啉-3-(哌啶-4-基）异噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）脲双三氟乙酸盐（GL-26)的制备
[0243]
[0244] 将 GL-l(471mg，lmmol)溶解在 4mL DCM 中，加入三乙胺（126mg，1.25mmol)。甲 氨基甲酰氯（103mg，l. lmmol)的DCM溶液缓慢加到上述混合物中，升温回流反应3d。加 入水，DCM萃取，水和饱和氯化钠溶液洗涤有机相，减压浓缩所得残余物通过柱层析纯化得 GL-2(447mg，收率 71% )。
[0245]
[0246] 将 GL-2(1. 342g，2. 54mmol)溶解在 40mL DCE 中再加入 ACE-C1(2. 910g， 20. 35_〇1)，室温下搅拌过夜。反应液浓缩至干，加入甲醇回流反应2h。减压蒸干甲醇得脱 苄基成盐酸盐的粗品（1.218g)。向所得粗品中加入50mL DCM和三乙胺（936mg，9. 25mmol) 并在冰浴下冷却到〇°C。将（Boc)20(618mg，2. 83mmol)的DCM溶液滴加到上述反应液中 搅拌反应3h。加入水，DCM萃取，有机相用水和饱和氯化钠洗涤，有机相减压浓缩，柱层 析纯化得白色固体 GL-37(1. 037g，收率 76% )。mp 152-154°C ? 4 NMR(300MHz, DMS0-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 22 (d, J = 9. 0Hz, 2H) , 7. 50 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 6H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 39 (tt, J = 10. 8, 3. 9Hz, 1H), 3. 1 4-2. 86(m, 2H), 2. 66(d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 09-1. 84(m, 4H), 1. 45 (s, 9H). ESI-MS:m/z = 538. 10[M+H]+.
[0247]
[0248] GL-37(330mg，0. 61mmol)溶解在 lmL DCM 中，加入 3mL TFA，室温下搅拌反应 2h， 减压蒸干，加入EtOH再减压蒸干，重复三次以除去残留三氟乙酸得黄色固体（405mg，收率 gg^hmpsiimr.iHNMRGooMHz.DMso-cgss.sguiHhs.soueo^iHhs.ei-s. 50 (m, 1H), 8. 28 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 53 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 21 (s, 1H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 55 (tt, J = 10. 8, 3. 9Hz, 1H), 3. 46-3. 41 (m, 2H), 3. 22-3. 12 (m, 2H), 2. 66 (s, 3H), 2. 34-2. 12 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 438. 62[M+H]+.
[0249] 实施例28
[0250] 利用GL-26制备l-(4-(3-(l-乙基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并 嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-27)
[0251]
[0252] 将 GL-26(100mg，0. 15mmol)悬浮在乙腈中加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)，冰盐浴降 温，将碘乙烷（29mg，0. 18mmol)的乙腈溶液缓慢滴加到反应液中，继续搅拌反应lh，升至室 温搅拌反应5h。TLC监测未反应完，在65°C下反应llh，然后回流反应8h。蒸干溶剂加入水， DCM萃取，再在pH = 14条件下用DCM/H20 = 20/1萃取，所得有机相柱层析纯化得黄色固体 GL-27 (48mg，收率69%)。11^ 209-210。(：.111匪1?(30011抱，01^0-(16)5 8.76(8，111)，8.26-8. 20 (m, 2H), 7. 54 - 7. 49 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 -3. 78 (m, 4H), 3. 15-3. 06 (m, 1H), 2. 99-2. 95 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 38 (q, J = 7. 2Hz, 2H), 2. 13-1. 90 (m, 6H), 1. 04 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 466. 74[M+H]+.
[0253] 实施例29
[0254] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (4-氟苄基）哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-28)
[0255]
[0256] 将 GL_26(100mg，0. 15mmol)悬浮在乙腈中加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)，室温下 搅拌2h。冰盐浴降温，将对氟溴苄（35mg，0. 18mmol)的乙腈溶液缓慢滴加到反应液中， 继续搅拌反应lh，然后室温下搅拌过夜，TLC监测反应完成。浓缩，加入水，DCM萃取，有 机相用水和饱和氯化钠洗涤，减压浓缩，残余物通过柱层析纯化得黄色固体（72mg，收率 88% ) 〇 mp 164-165°C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 25 - 8. 21 (m, 2H), 7. 54 - 7. 49 (m, 2H), 7. 41-7. 34 (m, 2H), 7. 20 - 7. 12 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 2Hz, 1H), 4. 06 -4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 52 (s, 2H), 3. 13-3. 08 (m, 1H), 2. 93-2, 89 (m, 2H), 2. 67 (d ,J = 4. 8 Hz, 3H),2. 14-2. 10 (m, 4H), 2. 04-1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 546. 44 [M+H]+.
[0257] 实施例30
[0258] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4-(7-吗啡啉-3-(1_(吡啶-3-甲基）哌啶-4-基） 异恶唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-29)
[0259]
[0260] 将 GL-26 (100mg，0? 15mmol)悬浮在乙臆中加入 DIPEA (117mg，0? 91mmol)，冰盐浴 降温，3-溴甲基P比啶盐酸盐（46mg，0. 18mmol)加到反应液中，继续搅拌反应lh，室温下搅拌 过夜，TLC监测反应进程。反应液减压浓缩，加入水，DCM萃取，有机相浓缩，柱层析纯化得黄 色固体（50mg，收率63%)。11^ 146-148。(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)5 8.79(8，111)，8.58- 8. 53 (m, 1H) ,8.52 - 8. 46 (m, 1H), 8. 28-8. 18 (m, 2H), 7. 84-7. 7 (m, 1H), 7. 57-7. 46 (m, 2H), 7. 43 - 7. 33 (m, 1H), 6. 09 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 19-3. 91 (m, 4H), 3. 90-3. 70 (m, 4H ),3. 59 (s, 2H), 3. 23-3. 05 (m, 1H), 3. 04-2. 80 (m, 2H), 2. 67 (d, J = 4. 2Hz, 3H) ,2.22-1.92(m, 6H). ESI-MS:m/z = 529. 65[M+H]+.
[0261] 实施例31
[0262] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4-(3-(1_(甲磺酰基）哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-30)
[0263]
[0264] 将GL-26(100mg，0. 15mmol)悬浮在无水 THF 中加入三乙胺（76mg，0. 75mmol)，冰浴 降温，甲磺酰氯（29mg，0. 18mmol)的THF溶液缓慢滴加到反应液中，继续搅拌反应lh，室温 下反应15h。TLC未反应完全，回流反应6h。抽滤析出的固体，滤液减压浓缩，然后加入水和 DCM萃取，有机相和滤饼结合柱层析纯化得白色固体（45mg，收率58% )。mp 261-263°C . 4 匪R (300MHz，DMS0-d6) S 8. 77 (s，1H)，8. 25-8. 22 (m，2H)，7. 53-7. 5 (m，2H)，6. 08 (q，J = 4. 5Hz, 1H), 4. 05-4. 04 (m, 1H), 3. 82-3. 80 (m, 2H), 3. 69-3. 65 (m, 2H), 3. 37-3. 30 (m, 1H), 3. 0 5-2. 98 (m, 2H), 2. 93 (s, 3H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 29-2. 25 (m, 2H), 2. 09-1. 96 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 516. 52 [M+H]+.
[0265] 实施例32
[0266] 利用GL-26制备1-(4-(3-(1_乙酰基-4-基）-7_吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-5-基）苯基）_3_甲脲（GL-31)
[0267]
[0268] GL-31是用乙酸酐通过过程B合成得到的土黄色固体（70mg，收率97 % )。mp 240-242 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 25 - 8. 21 (m, 2H), 7. 54-7. 49 (m, 2H) ,6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 44-4. 39 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 96-3. 91 (m, 1H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 50-3. 39 (m, 1H) ,3.35 - 3. 26 (m, 1H), 2. 91-2. 82 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 22-2. 12 (m, 2H), 2. 06 (s, 3H), 1. 94 - 1. 70 (m, 2H). ESI-MS: m/z = 480. 57 [M+H]+.
[0269] 实施例33
[0270] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4_(7-吗啡啉-3_(1-烟酰基哌啶-4-基）异噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-32)
[0271]
[0272] GL-32是由3-吡啶甲酰氯盐酸盐通过过程B合成得到的黄色固体（58mg，收 率 72 % )。mp 158-160。(： ? 4 NMR(300MHz，DMS0_d6) S 8. 78 (s，1H)，8. 67 (dd，J = 4. 5. 1. 5Hz, 2H), 8. 26-8. 23 (m, 2H), 7. 89 (dt, J = 7. 8, 1. 8Hz, 1H), 7. 53-7. 48 (m, 3H), 6 .08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 66-4. 44 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 82-3. 79 (m, 4H), 3. 7 5-3. 61 (m, 1H), 3. 57-3. 48 (m, 1H), 3. 46-3. 27 (m, 1H), 3. 27-3. 06 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 39-2. 09 (m, 2H), 2. 04 - 1. 91 (m, 2H). ESI-MS: m/z = 543. 46 [M+H]+.
[0273] 实施例34
[0274] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (4-氟苯甲酰基）哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-33)
[0275]
[0276] GL-33是由对氟苯甲酰氯通过过程B合成得到的白色固体（57mg，收率68% )。 mp 174-176 。(： /H 匪R(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.23(m，2H)，7.55- 7. 50 (m, 4H), 7. 33-7. 27 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 67-4. 30 (m, 1H), 4. 07 -4. 04 (m, 4H), 3. 91 - 3. 61 (m, 5H), 3. 60-3. 44 (m, 1H), 3. 42-3. 0 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 36-2. 08 (m, 2H), 2. 02 - 1. 89 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 560. 59[M+H]+.
[0277] 实施例35
[0278] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1-苯甲酰基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-34)
[0279]
[0280] GL-34是由苯甲酰氯通过过程B合成得到的黄色固体（77mg，收率95% )。 mp 175-177 。(： ? 4 Mffi(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.22(m，2H)，7.54- 7. 50 (m, 2H), 7. 49-7. 42 (m, 5H), 6. 08 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 75-4. 35 (m, 1H), 4. 06 -4. 03 (m, 4H), 3. 91 - 3. 61 (m, 5H), 3. 57-3. 46 (m, 1H), 3. 42-3. 0 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 36-2. 08 (m, 2H), 2. 03 - 1. 91 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 542. 70[M+H]+.
[0281] 实施例36
[0282] 利用GL-26制备4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-甲酸甲酯（GL-35)
[0283]
[0284] GL-35由氯甲酸甲酯通过过程B合成得到的白色固体（68mg，收率92 % )。 mp 228-230 °C /H Mffi(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.20(m，2H)，7.54-7. 49 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 6H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 64 (s, 3H) ,3. 42-3. 37 (m, 1H), 3. 14-3. 05 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 17-2. 11 (m, 2H), L 93 -1.80(m, 2H). ESI-MS:m/z = 496. 45[M+H]+.
[0285] 实施例37
[0286] 利用GL-26制备4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-甲酸异丙酯（GL-36)
[0287]
[0288] GL-36是由氯甲酸异丙酯通过过程B合成得到的白色固体（74mg，收率94% )。 mp 228-229 °C /H 匪R(300MHz，DMS0-d6)S8.78(s，lH)，8.24-8.20(m，2H)，7.53- 7. 48 (m, 2H) , 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H) , 4. 83 (sept, J = 6. 3Hz, 1H) , 4. 09 -4. 03 (m, 6H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 44-3. 35 (m, 1H), 3. 11-3. 01 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 13-2. 07 (m, 2H), 1. 95 - 1. 82 (m, 2H), 1. 23 (d, J = 6. 3Hz, 6H). ESI-MS:m/z = 524. 37 [M+H]+.
[0289] 实施例38
[0290] 利用GL-26制备N, N-二甲基-4-(5-(4_(3-甲脲基）苯基）-7_吗啡啉基异噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-甲酰胺（GL-38)
[0291]
[0292] GL-38由二甲胺基甲酰氯通过过程B合成得到的白色固体（75mg，收率98% )。 mp 152-154 。(： ? 4 Mffi(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.26-8.21(m，2H)，7.53- 7. 49 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3 .68-3. 64 (m, 2H), 3. 41-3. 30 (m, 1H), 3. 89-3. 0 (m, 2H), 2. 78 (s, 6H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 14-2. 09 (m, 2H), 2. 02 - 1. 89 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 509. 34 [M+H]+.
[0293] 实施例39
[0294] 利用GL-26制备叔丁基（2-甲基-1-(4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-吗啉基异 噁唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-基）-1_氧代丙基-2-基）氨基甲酸酯（GL-39)
[0295]
[0296] GL-39是由GL_26(150mg，0. 23mmol)和2_(叔丁氧羰氨基）异丁酸通过过程 A 合成的黄白色固体（117 mg，收率84%)。mp lSO-lSST.1!! NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 26-8. 21 (m, 2H), 7. 53 - 7. 49 (m, 2H), 7. 35 (s, 1H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 50-4. 54 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 40-3. 3 7 (m, 1H), 3. 24-2. 79 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 29-2. 03 (m, 2H), 1. 97 -1. 72 (m, 2H), 1. 35 (s, 1H). ESI-MS:m/z = 623. 42 [M+H]+.
[0297] 实施例40
[0298] 利用GL-26制备1-(4-(3-(1-(2-氰乙基）哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-40)
[0299]
[0300] GL-40是由氰基乙酸通过过程A合成得到的黄色固体（44mg，收率58% )。mp 258-260 °C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 24 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 7. 51 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 46-4. 3 (m, 1H), 4. 20-4. 04 (m, 6H), 3. 90-3. 68 (m, 5H), 3. 51 - 3. 44 (m, 1H), 3. 35 - 3. 27 (m, 1H), 3. 01-2. 94 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 21-2. 17(m, 2H), 2. 08-1. 94 (m, 1H), 1. 86-1. 73 (m, 1H). ESI-MS:m/z = 505. 72[M+H]+.
[0301] 实施例41
[0302] 利用GL-26制备1-甲基-3- (4- (7-吗啡啉-3- (1- (2, 2, 2-三氟乙基）哌啶-4-基） 异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-41)
[0303]
[0304] 将 GL-26 (100mg，0? 15mmol)悬浮在乙醇中加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和三 氟甲磺酸三氟乙酯（51mg，0.22mmol)，升温回流反应12h，TLC监测未反应完全，补加 DIPEA(23mg，0. 18mmol)和三氟甲磺酸三氟乙酯（21mg，0.09mmol)，继续回流反应5h。反 应液减压浓缩，加入水，DCM萃取，有机相减压浓缩，柱层析纯化得黄色固体（77mg，收率 98% ) 〇 mp 229-230°C . :H NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 25-8. 21 (m, 2H) ,7.54-7. 50 (m, 2H) , 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03(m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 30-3. 20 (q, J = 10. 2Hz, 2H), 3. 18-3. 11 (m, 1H), 3. 08-3. 02 (m, 2H), 2. 66 (d ,J = 4. 8Hz, 3H), 2. 63-2. 54(m, 2H), 2. 15 - 2. 09(m, 2H), 2. 05-1. 92(m, 2H). ESI-MS:m/z = 520. 41[M+H]+.
[0305] 实施例42
[0306] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4-(3-(l-(2_(甲砜基）乙基）哌啶-4-基）-7_吗 啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-42)
[0307]
[0308] 将 GL-26(100mg，0. 15mmol)悬浮在 n-BuOH 中加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)、 2-甲砜基溴乙烷（4111^，0.22臟〇1)和恥1(4111^，0.27臟〇1)，室温下搅拌，11(：监测反应 完成，抽滤得苍黄色固体（70mg，收率 85%)。mp NMR(300MHz，DMS0-d6) 8 9. 23 (s, 1H), 8. 22-8. 19 (m, 2H), 7. 54-7. 51 (m, 2H), 6. 44 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 36 - 3. 32 (t, J = 6. 3Hz, 2H), 3. 19 - 3. 07 (m, 1H), 3. 09 ( s, 3H), 3. 04-3. 0 (m, 2H), 2. 78 (t, J = 6. 6Hz, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 26-2. 19 (m, 2H) ,2. 12-1. 95 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 544. 57[M+H]+.
[0309] 实施例43
[0310] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4-(7-吗啡啉-3-(1-三氟乙酰基哌啶-4-基）异噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-43)
[0311]
[0312] GL-26(100mg，0. 15mmol)悬浮在乙腈中加入三乙胺解离，所得混合物减压浓缩 至干，加入无水DCM，冰盐浴降温，缓慢滴加2eq TFAA。滴完室温下搅拌过夜，TLC监测 反应未完成，补加1.2eq TFAA反应液立刻变澄清。反应液加入水，DCM萃取，有机相用 水和饱和氯化钠洗涤，柱层析纯化得白色固体（56mg，收率70% )。mp 203-205 °C NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 24-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H), 6. 07 (q ,J = 4. 8Hz, 1H), 4. 39-4. 32 (m, 1H), 4. 06 - 3. 98 (m, 5H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 64 -3. 52 (m, 2H), 3. 30 - 3. 22 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 36-2. 27 (m, 2H), 2. 08-1. 86 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 534. 59[M+H]+.
[0313] 实施例44
[0314] 利用GL-39制备1-(4-(3-(1-(2-氨基-2-甲基丙酰基）哌啶-4-基）-7-吗啡啉 基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲三氟乙酸盐（GL-44)
[0315]
[0316] GL-39(100mg，0. 16mmol)溶解在DCM中加入2mL TFA，室温下搅拌反应2h，浓缩 至干加入乙醇，再浓缩并加入石油醚，抽滤析出的固体得黄色产物（107mg，收率100% )。 mp 178-180 °C ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 88 (s，1H)，8. 24-8. 21 (m，2H)，8. 18 (s，3H)，7 .54-7. 51 (m, 2H), 6. 20 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 49-4. 20 (m, 2H), 4. 07 - 4. 04 (m, 4H), 3. 81 -3. 79 (m, 4H), 3. 61 - 3. 52 (m, 1H), 3. 40 - 3. 03 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 24-2. 20 (m ,2H), 2. 00-1. 98 (m, 2H), 1. 62 (s, 6H). ESI-MS:m/z = 523. 74[M+H]+.
[0317] 实施例45
[0318] 利用GL-26制备N, N-二甲基-2-(4-(5-(4-(3-甲脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-3-基）哌啶-1-基）乙酰胺（GL-45)
[0319]
[0320] GL-26 (100mg，0? 15mmol)悬浮在乙臆中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和 2_氯-N，N_二甲基乙酰胺（25mg，0.21mmol)，室温下搅拌过夜，加入Nal(27mg，0.18mmol) 继续搅拌反应l〇h。减压浓缩，加入水，DCM萃取，有机相用水和饱和氯化钠洗涤，柱层析 得黄白色固体（70mg，收率 90%)。mp lSQ-ieor.1!! NMR(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH ),8. 24-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 15-3. 94 (m, 4H), 3. 90 - 3. 66 (m, 4H), 3. 20 (s, 1H) ,3.16- 3. 09 (m, 1H), 3. 07 (s, 3H), 2. 97-2. 93 (m, 2H), 2. 83 ( s, 3H), 2. 66(d, J = 4. 2Hz, 3H), 2. 33-2. 26 (m, 2H), 2. 11-1. 94(m, 4H). ESI-MS:m/z = 523. 80[M+H]+.
[0321] 实施例46
[0322] 利用GL-26制备2- (4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并 嘧啶-3-基）哌啶-1-基）乙酰胺（GL-46)
[0323]
[0324] 将 GL-26 (100mg，0? 15mmol)悬浮在乙臆中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和 2_ 鹏 代乙酰胺（37mg，0.20mmol)，室温下搅拌反应8h。反应液减压浓缩，残余物溶解在氯仿 和甲醇中，加入水，氯仿萃取，有机相水和饱和氯化钠洗涤，减压浓缩，抽滤得黄白色固体 (86mg，收率 100 % )。mp 186-188。(： ? 4匪1?(30011抱，01^0-(16)5 8.99(8，111)，8.26-8. 20 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H), 7. 24 (s, 1H), 7. 13 (s, 1H), 6. 25 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 06 - 4. 04 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 15-3. 09 (m, 1H), 2. 96-2. 92 (m, 4H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 35-2. 26 (m, 2H), 2. 14 - 1. 99 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 495. 70[M+H]+.
[0325] 实施例47
[0326] 利用GL-26制备1-(4-(3-(1-(2-羟乙基）哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁唑[4, 5-d] 并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-47)
[0327]
[0328] 将 GL-26(100mg，0. 15mmol)悬浮在乙醇中，加入 DIPEA(71mg，0. 55mmol)、 Nal(27mg，0. 18mmol)和2-溴乙醇（25mg，0.20mmol)，回流反应60h。减压浓缩，加入水， 氯仿萃取，萃不干净，在pH = 14下萃取，所得有机相柱层析纯化得黄色固体（50mg，收率 69 % )。mp 198-199 °C ? 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) S 8. 77 (s，1H)，8. 24-8. 21 (m，2H)，7. 53 -7. 50 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 41 (t, J = 5. 1Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 54 (q, J = 6. 0Hz, 2H), 3. 11 - 3. 06 (m, 1H), 3. 01-2. 97 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 45(t, J = 6. 3Hz, 2H), 2. 23-2. 16 (m, 2H), 2. 11-1. 92 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 482. 70 [M+H]+.
[0329] 实施例48
[0330] 利用GL-26制备2- (4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-吗啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-基）乙酰乙酸乙酯（GL-48)
[0331]
[0332] GL-26 (100mg，0? 15mmol)悬浮在乙臆中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)和漠 乙酸乙酯（36mg，0. 22mmol)，室温下搅拌反应5h。反应液减压浓缩，加入水，DCM萃 取，有机相用水和饱和氯化钠洗涤，浓缩柱层析纯化得黄色固体（66mg，收率84% )。 mp 22卜223 。(： /H 匪R(300MHz，DMS0-d6)S8.77(s，lH)，8.25-8.21(m，2H)，7.54-7.4 9 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 11 (q, J = 7. 2Hz, 2H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 -3. 78 (m, 4H), 3. 29 (s, 2H), 3. 17 - 3. 07 (m, 1H), 2. 98-2. 94 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2 .48-2. 39 (m, 2H), 2. 13-1. 93 (m, 4H), 1. 22 (t, J = 7. 2Hz, 3H). ESI-MS:m/z = 524. 45 [M+H]+.
[0333] 实施例49
[0334] 利用GL-26制备1-(4-(3-(1-(2-甲氧基乙基）哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-49)
[0335]
[0336] GL-26 (lOOmg，0? 15mmol)悬浮在乙醇中，加入 DIPEA (71mg，0? 55mmol)、 Nal(27mg，0. 18mmol)和 2-甲氧基溴乙烧（27mg，0. 20mmol)，回流反应，TLC 监测 原料不再减少。反应液减压浓缩，加入水，DCM萃取，不能完全萃出产物，再在pH =14条件下萃取，所得有机相通过柱层析纯化得黄色固体（45mg，收率61 % )。mp 208-210 °C /H 匪 R(300MHz，DMS0-d6) 58. 77(s，lH)，8.24-8.21(m，2H)，7.53-7.50( m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 06-4. 03 (m, 4H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 48 (t, J = 5. 7Hz, 2H), 3. 26 (s, 3H), 3. 16 - 3. 09 (m, 1H), 3. 03-2. 98 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 60-2. 50 (m, 2H), 2. 27-2. 16 (m, 2H), 2. 12-1. 92 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 496. 57 [M+H]+.
[0337] 实施例50
[0338] 利用GL-48制备2- (4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-吗啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）哌啶-1-基）乙酸二三氟乙酸盐（GL-50)
[0339]
[0340] GL-48(110mg，0. 21mmol)溶解在 MeOH 中，加入 0? 21mL 2N NaOH 溶液，回流 反应6h。反应液冷却，浓盐酸调pH = 6,加入水，减压浓缩，残余物抽滤，滤饼干燥 后在室温下在TFA中搅拌lh。减压蒸干TFA得黄色固体（104mg，收率68% )。mp 240-242 °C . :H NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 10. 05 (s, 1H), 8. 87 (s, 1H), 8. 28-8. 25 (m, 2H), 7. 54-7. 51 (m, 2H), 6. 26-6. 11 (m, 1H), 5. 42 (s, 2H), 4. 19 (s, 2H), 4. 09-4. 02 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 75-3. 43 (m, 3H), 3. 43-3. 19 (m, 2H), 2. 66 (s, 3H), 2. 47-2. 16 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 496. 68[M+H]+.
[0341] 实施例51
[0342] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (2-羟基-2-甲基丙酰基）哌啶-4-基）-7-吗啡啉 基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-51)
[0343]
[0344] GL-51是由2-羟基异丁酸通过过程A合成得到的黄色固体（75mg，收率95% )。 mp 165-167 °C . NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 78 (s, 1H), 8. 25-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 49 (m ,2H), 6. 07 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 5. 44 (s, 1H), 5. 12-4. 69 (m, 1H), 4. 69-4. 32 (m, 1H), 4. 06 - 4. 03 (m, 1H), 3. 81 - 3. 78 (m, 1H), 3. 52-3. 42 (m, 1H), 3. 28-3. 05 (m, 1H), 3. 05-2. 77 (m, 1H), 2. 66(d, J = 4. 5Hz, 3H),2. 18-2. 12 (m, 2H), 2. 06-1. 70 (m, 2H), L 36 (s, 6H). ESI-MS:m/z = 524. 48 [M+H]+.
[0345] 实施例52
[0346] 利用GL-26制备4- (5- (4- (3-甲脲基）苯基）-7-吗啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-3-基）-N-吡啶-3-基）哌啶-1-硫代甲酰胺（GL-52)
[0347]
[0348] GL-26 (100mg，0. 15mmol)悬浮在乙腈中，加入3-弃硫氰酸酯基P比啶（50mg， 0. 37mmol)和DIPEA(28mg，0. 22mmol)，回流反应5h。减压浓缩至干，加入水，DCM萃 取，有机相用水和饱和氯化钠洗涤，减压浓缩，柱层析纯化得黄色固体（86mg，收率 100 % )。mp 183-185 °C ? 4 NMR (300MHz，DMS0-d6) 59.51 (s，lH), 8.79 (s，lH)，8.51 (d，J =2. 4Hz, 1H), 8. 32-8. 30 (m, 1H), 8. 28-8. 25 (m, 2H), 7. 80 - 7. 76 (m, 1H), 7. 54-7. 51 (m, 2H), 7. 37 (dd, J = 8. 1, 4. 5Hz, 1H), 6. 09 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 85-4. 80 (m, 2H), 4. 07 -4. 04 (m, 4H) ,3.82 - 3. 80 (m, 4H), 3. 65-3. 55 (m, 1H), 3. 52-3. 44 (m, 2H), 2. 67 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 25-1. 98 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 574. 26[M+H]+.
[0349] 实施例53
[0350] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4-(7-吗啉-3-(1-三氟甲磺酰基哌啶-4-基）异噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-53)
[0351]
[0352] GL-26(137mg，0.21mmol)悬浮在无水 THF 中，加入 DIPEA(96mg，0.74mmol)，冰浴 下冷却，将三氟甲磺酰氯（51mg，0. 30mmol)的THF溶液滴加到反应液中，继续搅拌反应lh， 室温下搅拌过夜，TLC监测反应未完全，升温至40°C反应5h并补加三氟甲磺酰氯（40mg， 0. 25mmol)。反应液浓缩，加入水，DCM萃取，有机相减压浓缩制备薄层色谱纯化得白色固体 (30mg，收率 26% )。mp 238-24(TC ? iHNMRGOOMHz, DMS0-d6) S 8. 78 (s, 1H)，8. 26-8. 21 (m, 2H ),7. 53-7. 50 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 07 - 4. 04 (m, 4H), 3. 97-3. 93 (m, 2H), 3. 81 - 3. 79 (m, 4H), 3. 58-3. 47 (m, 3H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 35-2. 21 (m, 2H), 2. 12 -1.99(m, 2H). ESI-MS:m/z = 570. 70[M+H]+.
[0353] 实施例54
[0354] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (2-氯乙酰基）哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁唑 [4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-54)
[0355]
[0356] GL-54由氯乙酰氯通过过程B合成得到的黄色固体（38mg，收率49 % )。mp 157-158〇C . NMR(300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 26-8. 21 (m, 2H), 7. 54-7. 49 (m, 2H), 6 ? 07 (d, J = 4. 8Hz, 1H)，4. 50-4. 36 (m, 3H)，4. 06-3. 89 (m, 5H)，3. 81-3. 78 (m, 1H)，3. 54-3. 44 (m, 1H), 3. 39 - 3. 33 (m, 1H), 3. 02-2. 94 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 16-1. 76 (m, 4H). ESI-MS:m/z = 514. 71[M+H]+.
[0357] 实施例55
[0358] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (3, 3-二甲基丁酰基）哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_甲脲（GL-56)
[0359]
[0360] GL-56由3,3-二甲基丁酸通过过程A合成的白色固体（80mg，收率99% )。 mp 153-155 °C ? 4 M!R(300MHz，DMS0-d6)S8.76(s，lH)，8.2-8.20(m，2H)，7.52-7. 48 (m, 2H), 6. 06 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 60-4. 47 (m, 1H), 4. 13 - 4. 02 (m, 5H), 3. 81 - 3. 78 (m, 4H), 3. 52-3. 40 (m, 1H), 3. 31 - 3. 25 (m, 1H), 2. 87-2. 78 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 30(q, J = 14. 1Hz, 2H), 2. 14 - 1. 77 (m, 4H), 1. 04 (s, 9H). ESI-MS: m/z = 536. 59 [M+H]+.
[0361] 实施例56
[0362] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (3, 5-二叔丁基苯甲酰基）哌啶-4-基）-7-吗啉基 异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-57)
[0363]
[0364] GL-57是由3, 5-二叔丁基苯甲酸通过过程A合成的白色固体（66mg，收率 eT^hmplSS-lSgr.iHNMRGOOMHz.DMSO-cUSS.TSUlHhSJT-S^UmJHhT.SS-7. 48 (m, 3H), 7. 23 (d, J = 1. 8Hz, 2H), 6. 06 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 77-4. 24 (m, 1H), 4. 07 -4. 04 (m, 4H) ,3.82 - 3. 59 (m, 5H), 3. 56-3. 46 (m, 1H), 3. 41 - 3. 02 (m, 2H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 17 - 1. 95 (m, 4H), 1. 30 (s, 18H). ESI-MS: m/z = 654. 93[M+H]+〇
[0365] 实施例57
[0366] 利用GL-26制备1- (4- (3- (1- (3, 5-二氟苯甲酰基）哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁 唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3_甲脲（GL-58)
[0367]
[0368] 61-58由3,5-二氟苯甲酸通过过程4合成的黄色固体（6〇11^，收率81%)。1^ 162-164 °C . NMR (300MHz, DMS〇-d6) 8 8. 77 (s, 1H), 8. 26-8. 21 (m, 2H), 7. 53-7. 50 (m, 2H) ,7. 36 (tt, J = 9. 6, 2. 4Hz, 1H), 7. 22 - 7. 19 (m, 2H), 6. 07 (q, J = 4. 5Hz, 1H), 4. 61-4. 39 (m ,1H), 4. 07-4. 04 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 71-3. 59 (m, 1H), 3. 58-3. 47 (m, 1H), 3. 40-3 .30 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 37-2. 06 (m, 2H), 2. 04 - 1. 90 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 578. 74 [M+H]+.
[0369] 实施例58
[0370] 利用GL-26制备1-(4-(3-(1-(2-(4_氟苯基）乙酰基）哌啶-4-基）-7_吗啉基 异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）-3-甲脲（GL-59)
[0371]
[0372] GL-59由GL-26 (86mg，0. 13mmol)和对氟苯乙酸通过过程A合成的黄色固体 (68mg，收率93%)。11^ 138-140。(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)58.78(8，111)，8.25-8. 20 (m, 2H), 7. 54 - 7. 50 (m, 2H) ,7.33 - 7. 28 (m, 2H), 7. 17 - 7. 09 (m, 2H), 6. 08 (q, J = 4. 8Hz, 1H), 4. 47-4. 42 (m, 1H), 4. 10-4. 03 (m, 5H), 3. 81 - 3. 78 (m, 6H), 3. 45 (tt, J = 11. 1, 3. 6Hz, 1H), 3. 33-3. 26 (m, 1H), 2. 94-2. 87 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 5Hz, 3H), 2. 15-2. 09 (m, 2H), 1. 85-1. 72 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 574. 91[M+H]+.
[0373] 实施例59
[0374] 利用GL-26制备1-甲基-3-(4-(7-吗啡啉-3-(1-(4-(三氟甲基）苯甲酰基）哌 啶-4-基）异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基）苯基）脲（GL-60)
[0375]
[0376] GL-60由GL-26(85mg，0. 13mmol)和三氟苯甲酸通过过程A合成的黄白色固 体（70mg，收率90%)。11^ 208-210。(：.111匪1?(30011抱，01^0-(16)8 8.76(8，111)，8.26-8. 23 (m, 2H), 7. 84 (d, J = 8. 1Hz, 2H), 7. 67 (d, J = 8. 1Hz, 2H), 7. 54 - 7. 49 (m, 2H), 6. 07 (q, J =4. 5Hz, 1H), 4. 66-4. 44 (m, 1H), 4. 06 - 4. 07 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 70-3. 58 (m, 1H) ,3. 58-3. 49 (m, 1H), 3. 43-3. 27 (m, 1H), 3. 25-3. 07 (m, 1H), 2. 66 (d, J = 4. 8Hz, 3H), 2. 38-2. 08 (m, 2H), 2. 08-1. 81 (m, 2H). ESI-MS:m/z = 610. 87[M+H]+.
[0377] 实施例60
[0378] 利用化合物1制备（3-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶-5-基）苯基）甲醇（GL-61)
[0379]
[0380] 将 1 (207mg，0. 5mmol)、3_ 轻乙基苯棚酸（114mg，0. 75mmol)、Pd(Pcy3)2Cl2(19mg， 0. 025mmol)和CsF(228mg，1. 5mmol)放入三口瓶中，抽真空排气再进Ar气，重复排气进气三 次，注射4mL溶剂（NMP/water = 9/1)，在Ar气保护下100°C反应48h。反应液中加入水和乙 酸乙酯萃取，有机相水洗再用饱和氯化钠洗三次，减压浓缩，柱层析和制备薄层色谱纯化得 黄色固体（44mg，收率18%)。11^ 87-89°(：.111匪1?(3001抱，0150-(16)58.32(8，111)，8.26-8. 23 (m, 1H), 7. 48-7. 43 (m, 2H), 7. 35 - 7. 23 (m, 5H), 5. 28 (t, J = 5. 7Hz, 1H), 4. 59 (d, J = 5. 7Hz, 1H), 4. 08 - 4. 05 (m, 4H), 3. 82 - 3. 79 (m, 4H), 3. 54 (s, 2H), 3. 22-3. 12 (m, 1H), 2. 95-2 .91 (m, 2H), 2. 23-1. 95 (m, 6H). ESI-MS:m/z = 486. 55[M+H]+.
[0381] 实施例61
[0382] 利用化合物1制备3-(3_(l-苄基哌啶-4-基）-7_吗啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧 啶_5_基）苯酚（GL-62)
[0383]
[0384] 将 1 (207mg，0. 5mmol)、3_ 羟基苯棚酸（103mg，0. 75mmol)、Pd(Pcy3)2Cl2(19mg， 0.025臟〇1)和〇8?(228111〖，1.51111]1〇1)置于三口瓶中抽真空排气再进41'气，重复排气进气 三次，注射4mL溶剂（NMP/water = 9/1)，在Ar气保护下100°C反应48h。反应液中加入 水和乙酸乙酯萃取，有机相水洗再用饱和氯化钠洗三次，减压浓缩，柱层析和制备薄层色 谱纯化得黄色固体（24mg，收率 10% )。mp 86-88°C ? 4 NMR(300MHz, CDC13) S 7. 93(d, J =7. 8Hz, 1H), 7. 83 (s, 1H), 7. 39 - 7. 25 (m, 5H), 6. 92 (dd, J = 7. 8, 1. 8Hz, 1H), 4. 13 -4. 10 (m, 4H) ,3.87 - 3. 84 (m, 4H), 3. 66 (s, 2H), 3. 19-3. 11 (m, 3H) ,2.33-2.11 (m, 7H). ESI-MS:m/z = 472. 31[M+H]+.
[0385] 实施例62
[0386] 制备1-(4-(3-(1-苄基哌啶-4-基）-7-吗啡啉基异噁唑[4, 5-d]并嘧啶-5-基） 苯基）-3-甲脲盐酸盐
[0387] 将GL-2 (528mg, lmmol)溶于10mL无水二氧六环中，加入0? 52mL自制的2. 3mol/ L的氯化氢无水二氧六环溶液，在室温下搅拌过夜，减压蒸干二氧六环，加入10mL无水二 氯甲烷超声洗涤，抽滤得白色固体（535mg，收率95% )。mp 255-257°C .ESI-MS:m/z = 528. 38 [M+H]+.
[0388] 试验实施例63
[0389] 本发明的具有式（I)结构的化合物及其药学上可接受的盐，在抗肿瘤方
[0390] 面有明显的效用，现通过以下药理实验说明：
[0391] 通过CCK-8检测试剂盒检测化合物对3个肿瘤细胞株（U-87MG，、PC-3和BT-474) 的细胞增殖半数抑制浓度IC 5。值。
[0392] 1、材料和方法
[0393] U-87MG人恶性胶质母细胞瘤细胞株（订购于中科院上海细胞资源中心）
[0394] PC-3人前列腺癌细胞株（订购于中科院上海细胞资源中心）
[0395] BT-474人乳腺癌细胞株（订购于中科院上海细胞资源中心）
[0396] Cell Counting Kit~8(Cat#CK04-13, Dojindo)
[0397] % 孔培养板（Cat#35"，Corning Costar)
[0398] 胎牛血清（Cat#10099_141，GIBC0)
[0399] 培养基（Invitrogen)
[0400] 台式酶标仪 SpectraMax MfSMicroplate Reader (Molecular Devices)
[0401] 2、实验步骤
[0402] 2. 1试剂配制
[0404] 化合物的制备：用DMS0稀释化合物使终浓度为10mM。
[0405] 2. 2 IC5。实验（CCK-8 检测）
[0406] 收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓 度（依照细胞密度优化试验结果确定），接种96孔板，每孔加100 y L细胞悬液。细胞在 37°C，100%相对湿度，5% C02培养箱中孵育24小时。用培养基将待测化合物稀释至所设置 的相应作用浓度（5X)，按25 y L/孔加入到细胞中。化合物作用终浓度从100 y M至0 y M，4 倍梯度稀释，共10个浓度点；或从10 y M至0 y M，4倍梯度稀释，共10个浓度点。然后将细胞 置于37°C，100%相对湿度，5% C02培养箱中孵育72小时。吸弃培养基，加入含10% CCK-8 的完全培养基置于37°C培养箱中孵育2-4小时。轻轻震荡后在SpectraMax M5Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。
[0407] 3、数据处理
[0408] 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％ = [(Ac-As)/ (Ac-Ab)] X100%
[0409] As:样品的0A (细胞+CCK-8+待测化合物）
[0410] Ac:阴性对照的 0A (细胞 +CCK_8+DMS0)
[0411] Ab:空白对照的0A (培养基+CCK-8+DMS0)
[0412] 运用软件 Graphpad Prism 5 并米用计算公式 log(inhibitor)vs. normalized response-Variable slope进行IC5。曲线拟合并计算出IC5。值。
[0413] 4、实验结果
[0414]


[0417] 试验实施例64
[0418] 式（I)所示化合物作为PIK3抑制剂的作用，通过以下试验说明
[0419] 应用 PI3_Kinase (human) HTRF? Assay kit 检测待测化合物对 PI3K delta 酶的抑 制作用及半数抑制浓度（IC5。)。
[0420] 1、材料和仪器
[0421] 2104 EnVision? Multi label Reader (Cat: 2104-0010, PerkinElmer)
[0422] 384well opaque balck plate (Cat. 6007270, PerkinElmer)
[0423] PI 3-Kinase(human)HTRF? Assay kit (Cat. 33-016, Millipore)
[0424] 4X Reaction Buffer (Cat. 33-002,Millipore)
[0425] PIP21mM(Cat. 33-004,Millipore)
[0426] Stop A(Cat. 33-006,Millipore)
[0427] Stop B (Cat. 33-008, Millipore)
[0428] DM A (Cat. 33-010, Millipore)
[0429] DM B (Cat. 33-012, Millipore)
[0430] DM C(Cat. 33-014, Millipore)
[0431] PI3K delta(Cat. 14-604,Millipore)
[0432] ATP 10mM(cat PV3227, Invitrogen)
[0433] DTT 1M(cat D5545, Sigma)
[0434] 2、试剂配制
[0435] 2. 11 X Reaction Buffer
[0436] 4XReaction Buffer (Cat. 33_0〇2, Millipore)用 ddH20 稀释至 IX，并加入1M DIT 使其终浓度为5mM。每次使用前新鲜配制。例如配制lOmL IX Reaction Buffer，加入2. 5mL 4XReaction Buffer，50yL 1M浓度的DIT和ddH20 7.45mL。整个实验中，用新鲜配制的 1 X Reaction Buffer配制ATP工作液，底物和酶混合工作液等。
[0437] 2. 24 X化合物工作液
[0438] 初筛：待测化合物用DMS0溶解至50 y M作为储存液，各取2 y L加入48 y L ddH20 中，得到2 y M含4 % DMS0的化合物溶液，混匀后各吸取2 y L加入18 y L 4 % DMS0(in ddH20)得到0. 2 y M化合物溶液。每个稀释溶液各取5 y L加入384孔板中，这样在最后的 20 y L激酶反应体系中化合物的终浓度就分别是500nM和50nM并含有1 % DMS0。
[0439] IC5。：待测化合物用DMS0溶解至10mM作为储存液，各取2 y L加入48 y L 1 XReaction Buffer中，得到400000nM含4% DMS0的化合物溶液，混匀后各吸取5 y L加 入下一个15 y L 4% DMS0(in 1 XReaction Buffer)的孔中，依次稀释下去得到10个浓 度梯度。每个稀释溶液各取5 y L加入384孔板中，这样在最后的20 y L激酶反应体系中 各个孔的化合物的终浓度就是 100000nM、25000nM、6250nM、1562. 5nM、390. 63nM、97. 65nM、 24. 42nM、6. 10nM、l. 53nM、0. 38nM并含有1% DMS0。10个测定浓度每个浓度为复孔。同时 选取CAL-101作为参考化合物，从2 y M开始4倍倍比稀释化合物。
[0440] 2.32XPIP2 工作液
[0441] 用lXreaction buffer配制2XPIP2工作液，使其终浓度为20 yM，PIP2的反应 终浓度为l〇yM，例如配制lmL lx reaction buffer/PIP2工作液，取20yL PIP2加入到 980 yL lXreaction buffer中。这个工作液要多配0.1-0.2mL,以满足对照使用和死体 积。
[0442] 2. 42 X PIP2/ 激酶工作液
[0443] 用2 X PIP2工作液稀释激酶，激酶工作液的浓度为80ng/wel 1。无激酶对照（可视 为100%抑制）即2XPIP2工作液。
[0444] 2.54XATP 工作液
[0445] 10mM的ATP用1 Xreaction buffer稀释至40 u M。在20 u L激酶反应体系中， ATP的浓度为10 y M。例如配制2mL ATP工作液，取8 y L 10mM浓度的ATP加入到1992 y L lXreaction buffer 中。
[0446] 2. 6终止液
[0447] Stop A和Stop B按3 :1的比例混合，室温放置至少2小时后才可用，终止液可在 室温下稳定12个小时。
[0448] 2. 7检测液
[0449] DM C、DM A和DM B按照18 :1 :1的比例混合，室温放置至少2小时后才可用，检测 液可在室温下稳定12个小时。
[0450] 3、实验流程
[0451] 实验流程如图1所示。
[0452] 4、数据分析
[0453] 计算各孔的 Emission Ratio (ER)
[0454] Emission Ratio(ER) = 665nm Emission signal/620nm Emission signal
[0455] 100%抑制对照的平均 Emission Ratio 记为：ER100%
[0456] 0%抑制对照的平均Emission Ratio记为：ER0%
[0457] 抑制率用以下公式计算：抑制率=(ERSMple-ERQ% ) AER1QQ% _ERQ%) X 100 %
[0458] 运用软件Graphpad Prism 5进行IC5。曲线拟合并计算出1C 5。值。
[0459] 5、实验结果


【主权项】
1. 一种式（I)所示的喀晚衍生物及其多种晶型体或其药学上可W接受的盐， 其中，Ri为氨，W C I-Ce为取代基的可选取代的芳基，可选取代的C I-Ce直链、支链或环状烧 基，酷二胺基，W面素、W可选取代的Ci-Ce直链、支链、环状烷基为取代基的芳基，W可选 取代的Ci-Ce直链、支链、或环状烷基为取代基的化晚基，W可选取代的C I-Ce直链、支链、 或环状烷基为取代基的讽基，W可选取代的Ci-Ce直链、支链或环状烷基为取代基的横酷 基，W可选取代的Ci-Ce直链、支链或环状烷基、化晚基、面代苯基、胺基、腊基、面代烷基为 取代基的幾基，可选取代的Ci-Ce直链、支链或环状醇基，醋基，酸基或簇基； Rz为氨，NHIV 或 NHCONHR3; 其中，所述Ri。为H或可选取代的C I-Ce直链、支链或环状烷基；所述R 2'为H或W Ci- Ce直链、支链烷基、Cs-Ce环烷基为取代基的可选取代的酷胺基，W可选取代的Ci-Ce直链、 支链或环状烷基为取代基的=取代胺基，W-个、两个或=个面原子为取代基的可选取代 的Ci-Ce直链、支链或环状烷基，C I-Ce直链或支链烷氧基，可选取代的C I-Ce直链、支链 或环状醇基，赃嗦基化晚基，胺基化晚基，赃嗦基芳基或面素为取代基的芳基；其中赃嗦基 和胺基为W可选取代的Ci-Ce直链、支链或环状烷基为取代基的取代赃嗦基和取代胺基； 所述Rs =可选取代的C I-Ce直链、支链或环状烷基W及可选取代的芳基； R。为氨、径基或可选取代的C1-C6直链、支链或环状醇基。2. 根据权利要求1所述的式（I)所示的喀晚衍生物及其多种晶型体或其药学上可W接 受的盐，其特征在于， (1)当Ri =可选取代的芳基，Rz= H时，Ro=-OH或Rn'OH，其中，R。'为可选取代的 Ci-Ce直链、支链或环状烷基； 当Ri =可选取代的芳基，R。二H时，或NHIV，其中，Ri。为H或可选取代 的Ci-Ce直链、支链、或环状烷基；R2' = H或CONHRs;其中，Rs= H，Ci-Ce直链、支链烷基， Cs-Ce环烷基，W C I-Ce直链或支链烷基为取代基的=取代胺基，一面代C I-Ce直链、支链 或环状烷基，二面代Ci-Ce直链、支链或环状烷基、=面代C I-Ce直链、支链或环状烷基，其中， 当X = N时，所述Ra= H、 ；肆NHRe,其中，Rs、Re独立地为Cl一 Ce直链或支链烧 基； 当X = C时，所述Ra= H、 面素，其中，R7 = H、Cl-Ce烷基、BOC或-，0; 所述Rs为可选取代的C I-Ce直链、支链或环状烷基； 所述Re为可选取代的C I-Ce直链、支链或环状烷基； 似当R。= H，R 1= NHCONHR3'时，Rz= CONHR…所述IV、Rii各自独立地为H、可选取 代的Ci-Ce直链、支链、或环状烷基； (3) 当R。= H，Ri= H或Cl-Ce直链、支链烷基时；Rz= NHCONHR3, Rs为可选取代的Cl- Ce直链、支链或环状烷基； (4) 当R。= H，Rz= NHCONHR 3,且Rs为可选取代的Cl一 Ce直链、支链或环状烷基时，其中， 所述Rii、R2。、Rzi各自独立地为H或可选取代的C 1一Ce直链、支链或环状烷基； 所述 Ri2、Ri3、Rl4a、Ri6、Rl8a、尺23、尺24、尺26、尺27、尺28、馬9、R3。、R3I、R32、R33、R34、各自独立地为可 选取代的Ci-Ce直链、支链或环状烷基； 所述Rm为可选取代的C I-Ce直链、支链或环状烷基或S面代C I-Ce直链、支链、或环 状烷基； 所述Ru为可选取代的C 1-。2直链、支链、环状烷基或W面素或C I-Ce直链、支链或环 状烷基为取代基的可选取代的芳控； 所述Ris、Ri迦立地为H、Boc或可选取代的C 1-C道链、支链、环状烷基； 所述Y = F、C1、化或I ; 所述Z为F、Cl、Br、I或氨。3.根据权利要求1所述的喀晚衍生物及其多种晶型体或其药学上可W接受的盐，其特 征在于， (1)当Ri =苄基，R2= H时.R。为辟其、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或下醇； 当 Ri =苄基，R O=H 时1皿2' 或 NHCONHR3; 其中， 所述Ri。为H、甲基、乙基、丙基或下基； 所述 IV = H 或 CONHRs; 所述Rs= H、甲基、乙基、丙基、异丙基、下基、环丙烷基、二甲基乙基胺、氣代乙基、二氣 代乙基、S氣代乙基-O-Rs或R gOH ; 其中，当X = N时，所述R4= H、NHRe,其中，Rs、Re独立地为甲基、乙基、丙基 或下基；当X = C时，所述Ra= H、所述R8为甲基、乙基、丙基或下基； 所述R9为甲基、乙基、丙基或下基； 似当R。= H时，Ri=畑CONHRs'化二CONHR…所述IV、Rii各自独立地为甲基，乙基、 丙基、异丙基或下基； (3) 当R。= H时，Ri = H、甲基、乙基、丙基、异丙基或下基时；R2= NHCONHR3, Rs=甲基、 乙基、丙基、异丙基或下基； (4) 当R。= H，R 2= NHCONHR 3, Rs=甲基、乙基、丙基、异丙基或下基时，所述Ri。、Rin R2。、Rzi各自独立地为H或甲基、乙基、丙基、异丙基或下基； 所述 Ri2、Ri3、Ri6、Rl8a、尺23、尺24、尺26、尺27、尺28、尺29、R3。、R3I、R32、R33、R34各自独立地为甲基、 乙基、丙基、异丙基、下基、异下基、环戊基或环己基； 所述Rm为甲基、乙基、丙基、异丙基、下基、一氣代C 1-C4直链或支链烷基、二氣代C 1-C4 直链或支链烷基、=氣代甲基、=氣代乙基、=氣代丙基、=氣代异丙基、=氣代下基或=氣 代异下基； 所述Ri5为甲基，乙基，丙基，异丙基，下基，异下基，环戊基，环己基，一氣代C 1-C4直链、 支链、环状烷基，二氣代C1-C4直链、支链、环状烷基，=氣代C1-C4直链、支链、环状烷基，W氣 或C1-C4直链、支链、环状烷基为取代基在对位、邻位、间位取代或未取代的苯基； 所述Ris、Ri迦立地为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、下基、异下基或Boc ; 所述Y = F ; 所述Z = F。4.根据权利要求1所述的喀晚衍生物及其多种晶型体或其药学上可W接受的盐，其特 征在于，为W下化合物之一：广）5. 权利要求1所述的喀晚衍生物及其多种晶型体或其药学上可W接受的盐的制备方 法，其特征在于由化合物1制备而成，所述化合物1的制备方法为：6. 细胞毒性剂，其特征在于，包含权利要求1-5中任一所述的喀晚衍生物及其多种晶 型体或其药学上可W接受的盐。7. 药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1-5中任一所述的的喀晚衍 生物及其多种晶型体或其药学上可W接受的盐W及药学上可接受的载体。8. 权利要求1-5任一所述的喀晚衍生物及其多种晶型体或其药学上可W接受的盐在 审Ij备细胞毒性剂W及抗肿瘤药物中的应用。9. 权利要求6所述的细胞毒性剂在制备针对PI3K激酶异常改变的药物W及抗肿瘤药 物中的应用。10. 权利要求7所述的药物组合物在制备制备针对PI3K激酶异常改变的药物W及抗肿 瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105985354SQ201510066655
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】郭家林, 裴亚中, 郎恒元
【申请人】南京盖特医药技术有限公司, 吉林大学