一种量子点标记的血红素铁的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种量子点标记的血红素铁的制备方法。(1)将油溶性量子点用无水乙醇洗，然后将其与修饰试剂PEG-NH2溶于氯仿，放入烧瓶中，超声，用旋转蒸发仪抽除氯仿，再加入B.R.缓冲液，吸出溶液，先过微米滤膜，再超滤，得到QDs-NH2；(2)将QDs-NH2与Hemin按物质的量比（1∶20）～（1∶80）加到PBS缓冲液中，然后加入连接剂EDC，在水平摇床上避光反应3h，再将反应液移入超滤管超滤，剩余液体即产物量子点标记的血红素铁QDs-Hemin。QDs-Hemin稳定性好，在体和细胞实验均证实其可用于研究血红素铁的体内外吸收机制。
【专利说明】-种量子点标记的血红素铁的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种血红素铁的制备方法，特别是一种量子点标记的血红素铁的制备 方法及其在体内外示踪血红素铁吸收方面的应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 铁是人体必需的微量元素之一，人体铁缺乏会导致贫血、智障等疾病。据世界卫生 组织统计，全球缺铁性贫血患者已达10亿人，这给人类的健康生活带来很大的威胁。铁主 要通过饮食获得，食物中的铁主要分非血红素铁和血红素铁。小肠是铁吸收的唯一部位，机 体主要通过控制小肠铁吸收达到铁代谢平衡，以保证各种生理过程正常进行。目前，非血红 素铁的小肠吸收机制已明确，而对于血红素铁的小肠吸收机制还不清楚。血红素铁，即吓啉 铁，由原卟啉与一分子Fe2+构成，是生物态铁。血红素铁来源于肉类食品中的肌红蛋白和血 红蛋白，如动物肝脏、瘦肉和鱼等，因此血红素铁的生物利用率Γ25%)高，机体约有2/3的 铁靠摄取血红素获得。据研究估计，虽然血红素铁只占摄入总量的1/3,但来自血红素的铁 占人均总铁的2/3。血红素铁可直接被小肠上皮细胞吸收，不产生消化道刺激，对于缺铁导 致的疾病，用补血红素铁来治疗应该是一种更为有效的手段，但其吸收机制不清楚，一味地 补铁，不但达不到有效的治疗目的，还有可能造成铁过多而导致其它疾病。因此，铁吸收机 制的研究，尤其是血红素铁的吸收机制研究日益重要。
[0003] 对于血红素铁吸收机制的研究，目前主要采用同位素（55Fe、59Fe、 14C)标记技术，但 同位素会对人体产生很大伤害。为了避免使用同位素带来的伤害，寻找一种替代技术用于 解决同位素标记带来的伤害具有重要意义。量子点（quantum dots, QDs)是一种新型的突光 标记试剂，具有独特的荧光性质：荧光发射波长可控、荧光强度高、光稳定性好、耐光漂白、 能实现一元激发多元发射等，在医学生物学上已被用于细胞、活体等靶向定位、免疫荧光标 记、信号转导、活体成像探针等。其中，核壳结构的CdSe/ZnS量子点，具有量子产率高、光学 性能稳定等特点，在生物学中被广泛应用。而对于以CdSe/ZnS为荧光标签，研究血红素铁 的吸收机制未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种量子点（QDs, CdSe/ZnS)标记血红素铁的制备方法， 该方法所得到的产物（QDs-Hemin)，在生理条件下稳定性好，在体和细胞实验均证实， QDs-Hemin可用于研究血红素铁的体内外吸收机制，解决了目前常用同位素作标记对人体 危害大的缺陷。
[0005] 本发明解决其技术问题采取的技术方案是这样的： 本发明利用旋转蒸发法制备量子点标记的血红素铁（QDs-Hemin),在QDs-NH2与Hemin 按物质的量比采用（1:20)?（1:80)时，均可制得产物。所得产物在生理条件下稳定性好， 在体和细胞实验均证实，QDs-Hemin可用于研究血红素铁的体内外吸收机制。
[0006] 具体的，本发明的量子点（QDs, CdSe/ZnS)标记的血红素铁的制备方法包括如下 步骤： (1) 将油溶性量子点用无水乙醇洗1次，条件是12000 rpm，5 min，然后将其与修饰试 齐IJPEG-NH2-同溶于氯仿，放入圆底烧瓶中，超声l~2min，用旋转蒸发仪抽除氯仿，再往圆底 烧瓶中加入B. R.缓冲液，控制pH=8. 4,吸出溶液，先过0. 22微米的滤膜，再放入100 KD的 超滤管中超滤，即得到水溶性的QDs_NH2 ; (2) 将步骤（1)所得到的QDs-NH2与Hemin按物质的量比（1 :20)?（1 :80)比例添加 到pH=7. 4的PBS缓冲液中，然后加入连接剂EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亚 胺)，在水平摇床上避光反应3h，再将反应液移入超滤管，7000 rpm，5 min超滤，剩余液体就 是产物量子点-血红素铁QDs-Hemin。
[0007] 本发明取得的有益效果如下： 本发明制备的QDs-Hemin，用于研究血红素铁的体内外吸收机制，可以揭示血红素铁在 Caco-2细胞的吸收机制，完善小肠铁吸收理论，同时丰富了铁代谢理论，为人体铁紊乱相关 疾病的预防、治疗和药物开发提供了理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1 :QDS-Hemin的紫外吸收和荧光发射图谱。
[0009] 图1A分别为QDs_NH2、Hemin和QDs-Hemin的紫外-可见吸收光谱。从图中可看 至丨J，QDs_NH2的特征吸收为579 nm，Hemin的特征吸收为390 nm和600 nm，分别是soret带 吸收和Q带吸收，在产物QDs-Hemin中同时出现了 QDs的特征吸收和Hemin的soret带特 征吸收，由此可证明该物质是QDs和Hemin的偶联物。图1B是QDs、QDs_NH2和QDs-Hemin 的荧光发射峰，由于油溶性QDs表面被成功修饰上-NH2和Hemin，所以相应产物的荧光发射 峰产生了红移。
[0010] 图2 :QDs_Hemin的粒径分布和zeta电位图。
[0011] QDs-Hemin的粒径分布采用动态光散射（DLS)技术测定，如图2A所示。从图中可 以看出，QDs-Hemin的粒径大小450 nm，这是由于在产物QDs-Hemin中，QDs的表面有残留 的-NH2，不同的QDs表面-NH2与-NH2之间形成了氢键，导致产物的动态光散射粒径较大。
[0012] Zeta电位是表征分散系稳定性的重要指标。从图2B可以看出，QDs-Hemin的Zeta 电位为-28 mV，表明采用旋转蒸发法制备的QDs-Hemin稳定性较好。
[0013] 图3 :QDs_Hemin在pH及NaCl中的稳定性。
[0014] 图3A和图3B是QDs-Hemin在pH值为5-9的R.缓冲液及不同离子强度的NaCl 溶液（0、0.05、0.15、0.45、11〇中的荧光强度。从图中看到008-他11^11不受？!1值和离子强 度的影响，可适用于生物体系。
[0015] 图4 :QDs-Hemin在Caco-2细胞中的吸收。
[0016] Caco-2细胞(人直肠癌细胞)在形态学及生化性质都与小肠上皮很相似，其模型已 被广泛地应用于体外营养物质分子肠吸收的研究。将QDs-Hemin分别孵育Caco-2细胞20 min、40 min、60 min、80 min,然后在多功能酶标仪上进行胞内突光强度检测，结果发现从20 min开始荧光强度就有极显著地增加，到60 min荧光强度达到最大值，80 min变化不明显， 说明60 min细胞已完成对QDs-Hemin的吸收。
[0017] 图5 :QDs-Hemin在小肠十二指肠的吸收。
[0018] 对正常的昆明小鼠进行十二指肠灌入QDs-Hemin 40 min后，取材，做冰冻切片，用 同步辐射微束X射线荧光光谱法测定Fe和Zn元素的含量(颜色深度不同，表示元素含量 多少不同）。从图5可知，无论对切片中的Fe (来自Hemin)定位（图5A)，还是对Zn (来自 QDs)定位（图5B)，所得到的图谱一致，即十二指肠吸收QDs-Hemin后，Fe和Zn共定位，这 说明QDs-Hemin能够进入十二指肠，并以整体形式被小肠吸收。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例用于说明本发明，但本发明的保护范围不受实施例的限制。
[0020] 实施例1制备量子点标记血红素铁 将油溶性量子点用无水乙醇洗1次（12000 rpm，5 min)，然后将其与修饰试剂 (PEG-NH2)溶于氯仿，放入圆底烧瓶中，超声l~2min。用旋转蒸发仪抽除氯仿，再往圆底烧 瓶中加入B. R.缓冲液（pH=8. 4)，吸出溶液，先过0. 22微米的滤膜，再放入100 KD的超滤管 中超滤，即得到水溶性的QDs-NH2。
[0021] 将QDs-NH2与Hemin按1 :20加到PBS缓冲液中，然后加入连接剂EDC (1-乙 基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亚胺)，在水平摇床上避光反应3h。再将反应液移入超滤管， 7000 rpm，5 min超滤，剩余液体就是产物，即量子点-血红素铁的偶联物QDs-Hemin。
[0022] 实施例2 QDs-Hemin的生理稳定性实验 配制一系列pH值为5~9的B. R.缓冲液，将QDs-Hemin加入到不同pH值的B. R.缓冲 液中，静置15h后，用荧光分光光度计分别测试QDs-Hemin在不同pH值溶液中的荧光强度， 激发波长为360 nm，考察pH值对QDs-Hemin荧光强度的影响。结果表明，QDs-Hemin荧光 强度不受pH值的影响，可用于生物体系。
[0023] 配制一系列浓度为0、0. 05、0. 15、0. 45、1 Μ的NaCl溶液，将QDs-Hemin加入到上述 不同离子强度的溶液中静置15h后，用荧光分光光度计分别测试QDs-Hemin在不同离子强 度溶液中的荧光强度，激发波长为360nm，考察离子强度对QDs-Hemin荧光强度的影响。结 果表明，QDs-Hemin荧光强度不受离子强度的影响，可用于生物体系。
[0024] 实施例3 QDs-Hemin在Caco-2细胞中的吸收 Caco-2细胞采用MEM培养基，同时加入20%的胎牛血清，终浓度为100IU/ml的青霉素 和100 μ g/ml链霉素。细胞在C02培养箱中培养，培养条件为37°C、5%C02、95%空气、100% 相对湿度。每5飞天按照1:4的比例传代，每三天换液一次，当细胞密度达到709Γ80%时， 换成基本培养基。同时加入QDs-Hemin孵育细胞。分别在37°C孵育Caco-2细胞20min、 40min、60min、80min，然后吸出培养液，用PBS洗三次，用多功能酶标仪定量检测进入细胞 内的QDs-Hemin。结果表明，60 min时，细胞已完成对QDs-Hemin的吸收。
[0025] 实施例4 QDs-Hemin在小肠十二指肠的吸收 腹腔注射戊巴比妥钠微麻醉小鼠，将其固定于泡沫板上，剪开腹部，从距胃幽门部1~2 cm处开始用细绳结扎，再距此结扎点:Γ4 cm处作为结扎的第二个部位，做成十二指肠圈， 用注射器向肠圈内注射QDs-Hemin至肠圈适度扩张为止，40 min后取材。用4%的多聚甲 醛固定液冲洗、固定十二指肠圈，4°C保存。再将组织浸泡于30%的蔗糖中，进行冰冻横切 片，-20°C保存备用。采用同步辐射微束X射线荧光法定量测定QDs和Hemin的含量。结 果发现，十二指肠吸收QDs-Hemin后，Fe和Zn共定位，说明QDs-Hemin能够进入十二指肠， 并以整体形式被小肠吸收。
[0026] 以上实施例证实：本发明制备的量子点标记的血红素铁QDs-Hemin，在生理条件 下，稳定性好，可用于研究血红素铁的体内外吸收机制，特别是用于体内外示踪血红素铁吸 收方面的应用。
[0027] 本发明中使用的化学物质的缩写式如下(物质的化学名称）： QDs :量子点 CdSe/ZnS :以硒化镉（CdSe)为核，硫化锌（ZnS)为壳的核壳型量子点 Hemin :氯化高铁血红素 QDs-Hemin :量子点-氯化高铁血红素偶联物 QDs-NH2 :氨基修饰的水溶性量子点 PEG-NH2 :氨基修饰的聚乙二醇 EDC :1_乙基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亚胺 Caco_2 :人直肠癌细胞。
【权利要求】
1. 一种量子点标记的血红素铁的制备方法，其特征是包括如下步骤： (1) 将油溶性量子点用无水乙醇洗1次，条件是12000 rpm，5 min，然后将其与修饰试 齐IJPEG-NH2-同溶于氯仿，放入圆底烧瓶中，超声l~2min，用旋转蒸发仪抽除氯仿，再往圆底 烧瓶中加入pH=8. 4的B. R.缓冲液，吸出溶液，先过0. 22微米的滤膜，再放入100 KD的超滤 管中超滤，得到水溶性的QDs-NH2 ; (2) 将步骤（1)所得到的QDs-NH2与Hemin按物质的量比（1 :20)?（1 :80)比例添加 到pH=7. 4的PBS缓冲液中，然后加入连接剂1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亚胺，在 水平摇床上避光反应3h，再将反应液移入超滤管，7000 rpm，5 min超滤，剩余液体为产物量 子点标记的血红素铁QDs-Hemin。
2. -种量子点标记的血红素铁的应用，其特征是其在体内外示踪血红素铁吸收的应 用。
【文档编号】C09K11/02GK104059626SQ201410293596
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】耿丽娜, 于鹏, 王严, 常彦忠, 段相林 申请人:河北师范大学