专利名称：胶质芽孢杆菌pm13菌株低粘度、高产率的发酵生产方法
技术领域：
本发明涉及一种胶质芽孢杆菌PM13菌株低粘度、高产率的发酵生产方法，特别是荚膜生成能力很强的新诱变菌株PM13的液体发酵工艺，该产品可以作为土壤微生物改良剂使用。
背景技术：
设施农业由于长期实行高集约化、高复种指数、高投入、连作重茬的种植模式， 造成设施土壤结构、理化及生物特性发生了很大变化，产生土壤盐渍化、营养失衡、微生物区系失衡等土壤障碍，成为制约设施农业可持续发展的主要因素(王辉，董元华，安琼等.高度集约化利用下蔬菜地土壤酸化及次生盐渍化研究.土壤，2005，37 (005) =530-533 ； Gormen H, Ozkan V K. A research on themicrofungal flora of some greenhouse soils in the vicinity of Lapseki ^anakkale, Turkey. Mycopathologia, 2002,153 (2) 103-112.)。目前土壤修复研究主要集中在土壤改良剂的开发。胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)是硅酸盐细菌的一种，具有分解硅酸盐矿物、溶磷、解钾、固氮等作用，目前广泛应用于生物肥料(吴小琴.硅酸盐细菌的应用概况.江西科学，1997，15(1) :60-66.)、矿物分解(贺积强，李登煜，张小平等.硅酸盐细菌的研究进展.西南农业学报，1999，12(1) :102-107.)、污水处理(Lian B, Chen Y， Zhao J, et al. Microbial Flocculation by Bacillusmucilaginosus AppIications and Mechanisms. Bioresource Technology, 2008,99 (11) :4825-4831.)等领域。胶质芽孢杆菌在生长过程中生成的有机酸和荚膜多糖使其具有盐离子吸附能力、土壤颗粒的团聚能力、解磷和解钾能力，并且当其在土壤中繁殖为优势菌群后，还可以达到抑制病原菌的效果 (孙德四，陈福山，张强.硅酸盐细菌特性及对硅铝的活化与吸持研究.苏州科技学院学报， 2005,18(4) J8-31 ；陈克亮，朱晓东，孙中党等.钾细菌在剩余污泥资源化中的应用.环境保护科学，2006，32 O) :46-48 ；程丽娟，来航线，李素俭，等.微生物对土壤团聚体形成的影响.西北农业大学学报，1994，22 ) :93-97.),所以该微生物在改良土壤结构、平衡营养、 去盐碱化和调节微生物区系失衡等土壤改良方面亦有很大的应用潜力，可以作为微生物土壤改良剂的生产菌种。目前，国内外关于胶质芽孢杆菌的应用研究主要集中在菌体增殖、矿物分解、生物絮凝等方面。这些研究的预期目的不同，进行菌体增殖培养时，目的是获得高产量的芽孢； 进行矿物分解时，培养基成分和培养条件应有利于矿物分解和矿物元素的浸出；进行生物絮凝时，主要关注的是与其荚膜多糖密切相关的絮凝剂的合成效率，因此胶质芽孢杆菌培养过程中考虑的因素、培养条件也各不相同。在菌体增殖培养方面，通过对培养条件的优化，目前的研究可以获得高于5X IO8CfVmL的芽孢产量，达到了我国微生物肥料产品标准所规定的浓度。吴向华等用液体发酵法生产胶质芽孢杆菌100130菌株的芽孢生成量为 9. 58X IO8CfuAiL(吴向华，刘五星.胶冻样芽孢杆菌培养条件及发酵工艺的优化.江苏农业科学，2006，(4) =155-158) 0胡秀芳等用液体发酵法生产胶质芽孢杆菌021120菌株的芽孢生成量为9.8X108cfu/mL，是目前所报道的最高的芽孢生成量(胡秀芳，应飞祥，陈集双.胶质芽孢杆菌突变株021120的培养条件及发酵工艺优化.中国生物工程杂志，2007， 27(9) 58-62)。肥厚的荚膜是胶质芽孢杆菌具有土壤调节能力的关键因素，胶质芽孢杆菌PM13 菌株是一株新诱变的突变菌株，其产荚膜能力远远强于未突变菌株，所以PM13菌株在土壤改良方面具有更大的应用潜力。但在菌体增殖培养过程中，过多荚膜的生成不仅消耗大量营养，抑制菌体生长，而且荚膜多糖会造成发酵液变粘稠，进而导致传质和流动困难，所以抑制荚膜的生长是降低发酵液粘度、促进菌体生长的有力手段。由于在适宜的条件下荚膜可以迅速再生，所以在菌体增殖培养过程中可以通过抑制荚膜生长同时达到降低发酵液粘度和提高菌体产量的目的。目前，主要是采用含氮培养基来抑制荚膜的生长(陈廷伟.钾细菌.北京农业出版社，1959. 4-7)，但PM13菌株在传统的淀粉铵培养基中芽孢生成量极低，只有IO3CfuAiL左右，因此本发明建立了一种适用于土壤改良的胶质芽孢杆菌PM13菌株低粘度、高产率的发酵生产方法。土壤改良是一个巨大的产业，市场需求量很大，以胶质芽孢杆菌PMl3菌株为出发菌株生产的微生物土壤改良剂有着广阔的市场前景。发明目的及内容本发明的目的是针对胶质芽孢杆菌PM13菌株，采用液体发酵方法，通过优化培养基成分和发酵条件解决该菌株在生产过程中芽孢生成量较低和发酵液粘度大的问题，提供了一种低成本、低粘度、高产率，适用于大规模机械搅拌式发酵罐的发酵工艺。本发明通过以下技术方案实现(1)菌种活化将保存的胶质芽孢杆菌PM13菌种作为菌种，划线接种到斜面培养基中，在30°C 34°C的条件下于培养箱中培养M 120h ；(2)种子液制备将步骤⑴得到的胶质芽孢杆菌PM13菌种接种到装有30 60mL 液体种子培养基的250mL三角瓶中，在30 34°C、200 250r/min的条件下摇瓶培养12 24h ；
(3)摇瓶培养将步骤⑵获得种子液接种到液体发酵培养基中，进行摇瓶培养， 培养工艺参数为种子液接种量为1 10%，250mL三角瓶装液量为30 60mL，初始pH为 7. 0 8. 0，发酵温度为32 36°C，摇床转速为200 250r/min，发酵时间为40 48h ；(4)发酵罐发酵或将步骤(2)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵，发酵工艺参数为接种量3 10 %，装液量60 80 %，消泡剂添加量 0. 01% 0. 06%，发酵温度32 36°C，搅拌速度200 700r/min，通气量0. 6 1. OM3A, 罐压0. 04 0. IMPa，溶氧30 100%，发酵pH值6. 0 8. 5，发酵时间35 48h。在上述技术方案中，各培养基组成分别为斜面培养基用蒸馏水配制，其组成为蔗糖 5g/L，石英砂 lg/L，K2HP042g/L, FeCl3O. 005g/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，CaCO3O. 5g/L，琼脂15 20g/L，pH值7. 5 ；液体种子培养基用蒸馏水配制，其组成为蔗糖5. 0 15. Og/L, K2HPO4L 0 3. Og/L, MgSO4. 7Η20 0· 0 2. Og/L, NaCl 0· 0 0. 5g/L, CaCO3L 0 5. Og/L, pH值7. 0 8. 0 ；液体发酵培养基用蒸馏水配制，其组成为糖蜜3. 0 5. Og/L,淀粉1. 0 3. 0g/L,豆粕粉 5. 0 10. 0g/L, CaC034. 0 10. 0g/L, K2HPO4L 0 3. 0g/L, MgSO4. 7H20 1· 0 3. 0g/L, NaCl 0· 0 0· 5g/L, pH 值 7· 0 8· 0。通过上述技术方案得到胶质芽孢杆菌ΡΜ13菌株发酵液芽孢生成量为0. 8
41. 5乂109(^11/!^，发酵液稠度系数低于0. 5Pasn。该技术具有原料便宜，工序简单，发酵周期短等优点。PM13菌株发酵液可以用于土壤改良，改善设施土壤的土壤盐渍化、营养失衡、微生物区系失衡等土壤障碍，因此本发明具有显著的经济和社会效益。
具体实施例方式具体实施方式
仅为本发明部分实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
具体实施方式
中使用的各培养基及其组成分别为斜面培养基用蒸馏水配制，其组成为蔗糖5g/L，石英砂lg/L，K2HP042g/L, FeCl3O. 005g/L, MgSO4. 7H20 0. 5g/L, CaCO3O. 5g/L,琼脂 15 20g/L，pH 值 7. 5 ;液体种子培养基用蒸馏水配制，其组成为蔗糖5. 0 15. Og/L, K2HPO4L 0 3. Og/L, MgSO4. 7Η20 0· 0 2. Og/L, NaCl 0· 0 0. 5g/L, CaCO3L 0 5. Og/L, ρΗ 值 7· 0 8. 0 ；液体发酵培养基用蒸馏水配制，其组成为糖蜜3. 0 5. Og/L，淀粉1. 0 3. Og/ L,豆粕粉 5. 0 10. 0g/L, CaC034. 0 10. 0g/L, K2HPO4L 0 3. 0g/L, MgSO4. 7H20 1· 0 3. Og/L, NaCl 0· 0 0. 5g/L, pH 值 7· 0 8· 0。实施例1(1)胶质芽孢杆菌ΡΜ13纯菌种接种于斜面培养基，在34°C培养48h，进行菌种活化；(2)将斜面种子接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于32°C以 200r/min转速摇瓶培养15h，即为种子液；(3)将种子液以的接种量接种于装有50mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于34°C以200r/min的转速摇瓶培养40h，获得芽孢生成量为1. 2X 109cfu/mL。实施例2(1)胶质芽孢杆菌PM13纯菌种接种于斜面培养基，在30°C培养120h，进行菌种活化；(2)将斜面种子接种于装有60mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于30°C以 250r/min转速摇瓶培养Mh，即为种子液；(3)将种子液以3%的接种量接种于装有30mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于36°C以250r/min的转速摇瓶培养40h，获得芽孢生成量为1. 4X 109cfu/mL。实施例3(1)胶质芽孢杆菌PM13纯菌种接种于斜面培养基，在32°C培养96h，进行菌种活化；(2)将斜面种子接种于装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于34°C以 200r/min转速摇瓶培养12h，即为种子液；(3)将种子液以10%的接种量接种于装有60mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于32°C以220r/min的转速摇瓶培养48h，获得芽孢生成量为1. 0X 109cfu/mL。实施例4(1)胶质芽孢杆菌PM13纯菌种接种于斜面培养基，在34°C培养40h，进行菌种活化；(2)将斜面种子接种于装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于32°C以 200r/min转速摇瓶培养15h，即为种子液；(3) IOL搅拌式发酵罐内加入7L液体发酵培养基，0. 03%消泡剂，121°C蒸汽灭菌 20min,冷却至;34°C，按5%接种量接入种子液，罐压0. 07MPa、通气量0. 8M3/h，搅拌速度0 6h 为 250r/min，6 35h 为 500r/min，溶氧 30 90%，控制 pH 值为 6. 0 8. 5，发酵 35h, 获得芽孢生成量为1. 2X 109cfu/mL。实施例5(1)胶质芽孢杆菌PM13纯菌种接种于斜面培养基，在30°C培养Mh，进行菌种活化；(2)将斜面种子接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于30°C以 250r/min转速摇瓶培养Mh，即为种子液；(3) IOL搅拌式发酵罐内加入6L液体发酵培养基，0. 01%消泡剂，121°C蒸汽灭菌 20min,冷却至32°C，按3%接种量接入种子液，罐压0. 04MPa、通气量0. 6M3/h，搅拌速度0 20h 为 250r/min, 20 34h 为 700r/min, 34 48h 为 200r/min,溶氧 30 80 %，控制 pH 值为6. 0 8. 5，发酵48h，获得芽孢生成量为0. 8 X 109cfu/mL。实施例6(1)胶质芽孢杆菌PM13纯菌种接种于斜面培养基，在30°C培养120h，进行菌种活化；(2)将斜面种子接种于装有60mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于34°C以 200r/min转速摇瓶培养20h，即为种子液；(3) IOL搅拌式发酵罐内加入8L液体发酵培养基，0. 06%消泡剂，121°C蒸汽灭菌 20min,冷却至36°C，按10%接种量接入种子液，罐压0. IMPa、通气量1. OM3A,搅拌速度0 18h 为 250r/min，18 ^h 为 500r/min，28 !35h 为 200r/min，溶氧 30 100 %，控制 pH 值为6. 0 8. 5，发酵40h,获得芽孢生成量为1. 5 X 109cfu/mL。
权利要求
1.一种胶质芽孢杆菌PM13菌株低粘度、高产率的发酵生产方法，其具体过程为(1)菌种活化将保存的胶质芽孢杆菌PM13菌种作为菌种，划线接种到斜面培养基中， 在30°C 34°C的条件下于培养箱中培养M 120h ；(2)种子液制备将步骤⑴得到的胶质芽孢杆菌PM13菌种接种到装有30 60mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在30 34°C、200 250r/min的条件下摇瓶培养12 24h ；(3)摇瓶培养将步骤( 获得种子液接种到液体发酵培养基中，进行摇瓶培养，培养工艺参数为种子液接种量为1 10 %，250mL三角瓶装液量为30 60mL，初始pH为7. 0 8. 0，发酵温度为32 36°C，摇床转速为200 250r/min，发酵时间为40 48h ；(4)发酵罐发酵或将步骤( 获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵，发酵工艺参数为接种量3 10 %，装液量60 80 %，消泡剂添加量 0. 01% 0. 06%，发酵温度32 36°C，搅拌速度200 700r/min，通气量0. 6 1. OM3A, 罐压0. 04 0. IMPa,溶氧30 100%，发酵pH值6. 0 8. 5，发酵时间35 48h。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是斜面培养基用蒸馏水配制，其组成为蔗糖 5g/L，石英砂 lg/L，K2HP042g/L, FeCl3O. 005g/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，CaCO3O. 5g/L，琼脂 15 20g/L，pH 值 7. 5。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是液体种子培养基用蒸馏水配制，其组成为蔗糖 5. 0 15. Og/L, K2HPO4L 0 3. Og/L,MgSO4. 7Η20 0· 0 2. 0g/L，NaCl 0· 0 0. 5g/ L, CaCO3L 0 5. Og/L, pH 值 7· 0 8· 0。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是液体发酵培养基用蒸馏水配制，其组成为糖蜜 3. 0 5. Og/L,淀粉 1. 0 3. Og/L,豆粕粉 5. 0 10. 0g/L, CaC034. 0 10. 0g/L, K2HPO4L 0 3. 0g/L, MgSO4 · 7H20 1· 0 3. 0g/L, NaCl 0· 0 0· 5g/L, pH 值 7· 0 8· 0。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是获得的胶质芽孢杆菌ΡΜ13菌株发酵液芽孢生成量为0. 8 1. 5Χ 109cfu/mL，发酵液稠度系数在0. 5Pasn以下，采用普通的机械搅拌式发酵罐进行发酵生产。
全文摘要
本发明涉及一种胶质芽孢杆菌PM13菌株低粘度、高产率的发酵生产方法。将胶质芽孢杆菌新突变菌株PM13经斜面培养基活化和液体种子培养基培养得到种子液，再将得到的种子液接种于适宜的发酵培养基中采用摇瓶或发酵罐培养，得到芽孢产量在0.8～1.5×109cfu/mL，发酵液稠度系数在0.5Pasn以下的发酵液，此发酵液可以作为微生物土壤改良剂。与其他土壤改良剂相比，本发明所用菌株为新突变菌株，可采用摇瓶或常规机械搅拌式发酵罐生产，具有发酵时间较短、发酵成本低、产量高等特点，具有更大的应用潜力。
文档编号B09C1/10GK102260637SQ20101019433
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者王晓东, 王雪, 袁晓凡, 赵兵 申请人:中国科学院过程工程研究所