专利名称：一种微生物絮凝剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物絮凝剂以及该微生物絮凝剂的生产方法。
背景技术：
絮凝技术是提高水质处理效率的一种既经济又简便的处理方法，被广泛地应用于工业废水处理、给水处理、食品生产和发酵等工业中。而在水处理方面，絮凝能有效去除 80% -95%的悬浮物质和65% -95%的胶体物质，可有效降低水中的COD值；并且通过絮凝净化，通常能将水中90%以上的微生物和病毒一并转入污泥中，使得对水进行消毒和杀菌变得容易。絮凝效果如何关键取决于絮凝剂的选择上。絮凝剂作为一种可使液体中不易沉降的固体悬浮微粒凝聚沉淀而将其去除的物质，有着悠久的应用历史。目前，絮凝剂分为无机絮凝剂、有机絮凝剂和微生物絮凝剂三种。 尽管无机和有机絮凝剂因其具有良好的絮凝效果和较低的成本而得到广泛应用，然而它们在使用过程中给环境造成的二次污染不得不引起人们的重视。研究表明，无机絮凝剂中的铝离子易引起老年性痴呆症；铁盐絮凝剂中的铁盐对金属有腐蚀作用，可造成处理水中带有颜色，易形成某些难絮凝沉淀的化合物；而有机类絮凝剂聚丙烯酞胺类絮凝剂的合成单体丙烯酞胺具有累积性神经毒性，已被确定为有基因毒性的致癌物。相比之下，利用生物技术，通过微生物发酵、分离提取其代谢产物而得到的微生物絮凝剂具有高效、安全无毒、可生物降解、对环境和人类健康无害等优点，对人类的健康和环境的保护具有很重要的现实意义。因此，微生物絮凝剂具有广阔的应用前景。我国也将研究开发微生物絮凝剂列为《生物技术中长期发展纲要》的主攻方向之一。微生物絮凝剂是一种代表着絮凝剂发展方向的新型水质处理剂，它由特殊代谢功能的微生物所产生，其功能表现为对液体体系中悬浮颗粒、反离子等进行吸附、絮凝去除。 而微生物絮凝剂的制备属于特殊功能生物大分子制剂生产的生物技术。目前，很多国家对微生物絮凝剂进行了研究，筛选出多种能够产生絮凝剂的微生物，包括细菌，霉菌，酵母菌，放线菌和藻类等，并在絮凝条件、絮凝机理；絮凝剂分离纯化、 性质、应用；产絮凝剂的基因控制等诸方面进行了一系列的研究。这些具有絮凝活性、被人关注的微生物大都筛选自土壤、淤泥、污水。尽管微生物絮凝剂具有无毒、无二次污染及生物可降解的特点，但由于其具有生产成本高，发酵周期长，絮凝效率低，产絮凝剂的性状不稳定等缺点，因此目前还没有进行大规模的工业化生产。申请人:之前对污水中的微生物絮凝剂产生菌进行了一系列研究，并发表了两篇文献，其中《絮凝剂产生菌的筛选及应用》(地球与环境，2008年第36卷第2期)中公开了两株絮凝剂产生菌，使用培养液作为微生物絮凝剂，但在该文成文时并没有研究出微生物絮凝剂生产菌的发酵培养以获得发酵液的条件，也未对其产生的絮凝剂进行提纯。使用培养液作为絮凝剂虽然操作简便，但需要使用很大量的发酵培养液，所以工业应用很不方便，也可能造成二次污染。而另一篇《Galactomyces sp.产生的生物絮凝剂絮凝活性研究》(地球与环境，2008年第36卷第3期)中公开了 Galactomyces sp.产生的生物絮凝剂絮凝活性的研究，但该研究中只公开了絮凝剂的粗制品，但其粗制品的制备条件并未进行反复试验， 其制备条件并不是最大限度提取出了发酵液中的絮凝沉淀物，而且文献中并未公开絮凝剂的纯品，也未公开絮凝剂纯品的提纯方法。并且絮凝剂粗制品用量大，絮凝效果不如絮凝剂纯品。
发明内容
本发明的目的在于通过进 一步实验，针对上述已有技术存在的不足，提供一种简单、易行，可大规模工业化应用的产生高效微生物絮凝剂纯品的方法。本发明通过进一步实验在原有研究的基础上改进了微生物絮凝剂生产菌的发酵培养中种子液培养和发酵液培养的培养基配方的用量以及培养条件，使其更有利于本发明的微生物产生絮凝剂，并且对产生的微生物絮凝剂进行了提纯实验，改进了絮凝剂粗品的制备条件，使其能最大限度提取出发酵液中的絮凝沉淀物，通过实验找到了最适合本发明的微生物絮凝剂纯品的制备方法，经提纯后可产生高效的微生物絮凝剂。本发明通过从污水处理厂中分离出的多种菌株中筛选出一株可作为微生物絮凝剂生产菌的菌株，该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年6月2日，保藏号为CGMCC 2535，分类命名Galactomyces geotrichum。该菌生产絮凝剂的方法简单，易行，发酵时间短，生产成本低；所产絮凝剂适用温度为10-80°C，适用pH为3-9，根据不同处理对象用量范围为0. lml/L-lml/L,展现了其广泛的实际废水应用潜力，具有很好的推广价值；对废水处理实验表明，该絮凝剂应用后，絮凝效果比较理想，絮凝效率高。经提取生产的微生物絮凝剂絮凝效率高、无毒无害、应用无二次污染、可生物降解、可进行大规模推广应用等特点，具有广阔的应用前景。本发明的另一个目的在于提供利用上述菌株制得的微生物絮凝剂。在一个具体实施方案中，本发明的制备方法包括如下步骤(a)通过从污泥中筛选来确定最适宜作为微生物絮凝剂生产菌的菌种；(b)微生物絮凝剂生产菌的液体培养基的配制；(c)微生物絮凝剂生产菌的发酵培养；(d)微生物絮凝剂粗品的预制备；(e)微生物絮凝剂的制备。在一个更具体的实施方案中，微生物絮凝剂生产菌为CGMCC 2535。在一个实施方案中，其中(a)步骤如下活性污泥一稀释一增殖培养一平板分离一挑取菌落一纯化培养一初筛一富集培养一复筛一产絮凝剂菌种一菌种保存。在另一个实施方案中，其中(a)步骤的具体步骤如下以污水处理厂的活性污泥作为菌种来源样品，按常规方法制备培养基(根据活性污泥中常规所含菌种来选择常用的培养基，如常用的固体培养基(1)牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，H2O 1000ml，用10% NaOH调节溶液ρ Η7.0，琼脂 15g ；(2)查氏培养基蔗糖 6g，FeSO4 0. 002g, K2PO4 1. 0g, (NH4)2SO4 1. 0g, KCl 0. 5g, NaNO33. Og，MgSO4 O. 5g，琼脂 15g，H20 1000ml,pH7. O ； (3)通用发酵培养基葡萄糖 20g，(NH4)2SO4 0. 2g，尿素 0. 5g，MgSO4 0. 5g, FeSO4 0.01g，NaCl 0. 5g, KH2PO4 2. 0g，酵母膏 0. 5g，琼脂 15g， H2OlOOOml, pH7. 0 ； (4)高氏一号培养基可溶性淀粉 4g，KNO3 3. Og, K2HPO4 0. 5g，MgSO4 0. 5g, FeSO4 0.01g，NaCl 0. 5g，琼脂 15g，H2O 1000ml，ρΗ7· 0。筛选和富集所用的液体培养基与固体培养基的一致，只是均不含琼脂)，采用稀释涂布平板分离法对样品进行微生物菌种分离，待形成单菌落后，按初步判定的各单菌落所用的固体培养基配制液体培养基，按常规方法将单菌落接种于液体培养基中进行空气浴震荡器震荡培养，制备成微生物培养液。 对所培养的微生物进行初筛，初筛的目的是为了找出能够产生微生物絮凝剂的菌种。初筛的方法为在试管中装入浓度为4g/L的高岭土悬浮液20ml，加入2-3滴培养后的微生物发酵液，观察是否有絮团生成，若有絮团生成，则说明该菌具有絮凝效果，能够作为候选微生物絮凝剂进行培养。将获得的具有絮凝效果的候选菌株，采用平板划线法对所培养的候选菌株进行分 离和纯化，获得纯菌株，并制备成微生物培养液，浓度为0. 2g/L，对高岭土悬浮液进行絮凝处理，并测定絮凝率，絮凝率的确定如下在IOOOml烧杯中加入IOOOml蒸馏水，4g高岭土，0. 2g的CaCl2，配制4g/L的高岭土悬浊液。用量筒量取IOOml的高岭土悬浊液，加2ml的微生物培养液，搅拌后静置3min，取50ml上清液在722型分光光度计上测定光密度值0D550，以不加微生物培养液的高岭土悬浮液作为对照，通过下列公式确定絮凝率 E(% )E(%) = (A-B)/AX 100%,其中，A为絮凝处理前550nm处的光密度值；B为絮凝处理后550nm处的光密度值。 所筛选的微生物絮凝剂絮凝率最高在92%以上，将其作为研究对象，并进行鉴定，经鉴定该菌种为 Galactomyces geotrichum，经保藏为 CGMCC 2535。在一个实施方案中，其中(b)步骤的液体培养基具体配方为以IOOOml蒸馏水计， 蔗糖 18g，FeSO4 0. 006g, K2PO4 0. 6g, (NH4)2SO4 0.6g，KCl 0. 3g, NaNO3 1. 8g, MgSO4 120. 3g, 调至pH7. 0。在一个实施方案中，其中(C)步骤包括种子液培养和发酵液培养，其各自的具体步骤如下将液体培养基装入200ml种子培养容器中，培养基装入量为100ml，高压灭菌， 冷却后接种CGMCC 2535菌株，然后将种子培养器放入空气浴恒温震荡器中，在29°C -37°C 下培养 18h-36h,通气量为 0. 5-1. OL/min,转速为 190_350r/m，获得 Galactomyces geotrichum CGMCC2535 种子培养液。再将 Galactomyces geotrichum CGMCC 2535 种子培养液按体积5-20%的接种量加入培养基，使用与种子培养基相同的培养基，在30-40°C条件下进行有氧发酵，通气量为0. 5-1. OL/min，转速100_350r/m，培养时间为48h，以此获得 Galactomyces geotrichum CGMCC2535 发酵液。在一个实施方案中，其中(d)步骤的具体步骤如下将发酵液在6000-9000r/min 离心20-30min去除菌体，将离心分离后的液体加入3倍体积的4°C的乙醇，在4°C条件下放置12h以上，可见絮凝沉淀物产生，该絮凝沉淀物为絮凝剂，在4000r/min条件下离心30min 将乙醇与絮凝沉淀物分离。将离心后的絮凝沉淀物真空干燥5-6h，获得絮凝剂粗制品。其中真空干燥条件为温度为60士2°C，真空度为0. 06MPao在一个实施方案中，其中(e)步骤的具体步骤如下将絮凝剂粗品溶解于无菌水中，加入3倍无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂，4000r/min离心30min，收集沉淀，再重新溶解于蒸馏水中，制成絮凝剂溶液。将絮凝剂溶液装入MV10000透析袋里，去离子水中4°C透析 24小时，每隔8小时换一次透析外液。将透析内液加入3倍无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂， 4000r/min离心30min收集沉淀，真空干燥后得絮凝剂纯品。该菌生产絮凝剂的方法简单，易行；该絮凝剂适用温度为10-80°C，适用pH为3-9， 根据不同处理对象用量范围为0. lml/L-lml/L，展现了其广泛的实际废水应用潜力，具有很好的推广价值；对废水处理实验表明，该絮凝剂应用后，絮凝效果比较理想。经提取生产的微生物絮凝剂絮凝效率高、无毒无害、应用无二次污染、可生物降解、可进行大规模推广应用等特点，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝非是限制。实施例1Galactomyces geotrichum CGMCC 2535 的筛选以污水处理厂(北京清河污水处理厂)的活性污泥作为菌种来源样品，按常规方法制备培养基，采用稀释涂布平板分离法对样品进行微生物菌种分离，待形成单菌落后，按各单菌落所用的固体培养基配制液体培养基，按常规方法将单菌落接种于液体培养基中进行空气浴震荡器震荡培养，制备成微生物培养液。对所培养的微生物进行初筛。初筛的方法为在试管中装入浓度为4g/L的高岭土悬浮液20ml，加入2-3滴培养后的微生物发酵液， 观察是否有絮团生成，若有絮团生成，则说明该菌具有絮凝效果，能够作为微生物絮凝剂进行培养。将获得的具有絮凝效果的细菌菌株，采用平板划线法对所培养的细菌菌株进行分离和纯化，获得纯菌株，并制备成微生物培养液，对高岭土悬浮液进行絮凝处理，絮凝率的确定如下在IOOOml烧杯中加入IOOOml蒸馏水，4g高岭土，0. 2g的CaCl2，配制4g/L的高岭土悬浊液。用量筒量取IOOml的高岭土悬浊液，加一定量的微生物培养液，搅拌后静置 3min,取50ml处上清液在722型分光光度计上测定光密度值0D550，以不加微生物培养液的高岭土悬浮液作为对照，计算絮凝率。将所产微生物絮凝剂絮凝率最高的菌种作为研究对象，并进行鉴定，经鉴定该菌种为Galactomyces geotrichum,实验室命名为M2，并经保藏为 CGMCC 2535。测定其絮凝率在92%以上。实施例21.絮凝剂的制备
包括如下步骤a)通过从污泥中筛选来确定最适宜作为微生物絮凝剂生产菌的菌种；Galactomyces geotrichum CGMCC 2535 的获得方法同实施例 1b)微生物絮凝剂生产菌的液体培养基的配制；液体培养基具体配方为以IOOOml蒸馏水计，蔗糖18g，FeSO4 0. 006g, K2PO4 0. 6g, (NH4)2SO4 0. 6g，KCl 0. 3g, NaNO3 1. 8g, MgSO4 120. 3g, pH 自然。优选将调至 ρΗ7·0。C)微生物絮凝剂生产菌的发酵培养；将液体培养基装入200ml种子培养容器中，培养基装入量为100ml，高压灭菌，冷却后接种CGMCC 2535菌株，然后将种子培养器放入空气浴恒温震荡器中，在29°C -37°C 下培养 18h-36h,通气量为 0. 5-1. OL/min,转速为 190_350r/m，获得 Galactomyces
6geotrichum CGMCC2535 种子培养液。再将 Galactomyces geotrichum CGMCC 2535 种子培养液按体积5-20 %的接种量加入培养基，使用与种子培养基相同的培养基，在30-40°C条件下进行有氧发酵，通气量为0. 5-1. OL/min，转速100_350r/m，培养时间为48h，以此获得 Galactomyces geotrichum CGMCC2535 发酵液。d)微生物絮凝剂粗品的预制备；将发酵液在6000-9000r/min下离心20_30min去除菌体，将离心分离后的液体加入3倍体积的4°C的乙醇，在4°C条件下放置12h以上，可见絮凝沉淀物产生，在4000r/min 条件下离心30min将乙醇与絮凝剂粗品沉淀分离。将离心后的固相真空干燥5-6h，获得絮凝剂粗制品，其中真空干燥条件为温度为60°C 士2°C，真空度为0. 06MPaoe)微生物絮凝剂纯品的制备；将絮凝剂粗品溶解于无菌水中，加入3倍无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂，4000r/min 离心30min，收集沉淀，再重新溶解于蒸馏水中。将絮凝剂溶液装入MV10000透析袋里(用 0. 5mol/LEDTA煮沸处理后)，去离子水中4°C透析24小时，每隔8小时换一次透析外液。将透析内液加入3倍无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂，4000r/min离心30min收集沉淀，真空干燥后得絮凝剂纯品。经测定其主要成分为多糖。2.絮凝效果测试固体部分加入与离心上清液等量的水，混勻待用。于100毫升 0. 4%的高岭土中，加入0. 3毫升微生物絮凝液，未调pH值，充分混勻后，静置6分钟，原来浑浊的高岭土悬浊液迅速结团沉淀，固液界面清晰，取上清液测定550nm下的OD值，絮凝率达到95. 6%。实施例31.絮凝剂的制备a)至e)步骤同实施例2。2.絮凝效果测试絮凝剂固体加入与过滤清液等量的水，混勻后待用，在100毫升稀释50倍的蓝黑墨水中，加入微生物絮凝液0. 3毫升，充分混勻，静置片刻即产生明显的絮凝现象，120分钟后蓝色絮凝物沉淀，比色测定脱色率达到81. 46%。该菌生产絮凝剂的方法简单，易行；该絮凝剂适用温度为10-80°C，适用pH为3-9， 根据不同处理对象用量范围为0. lml/L-lml/L，用量少。经提取生产的微生物絮凝剂絮凝效率高、无毒无害、应用无二次污染、可生物降解、可进行大规模推广应用，适用范围广，如污水的处理，包括生活污水、工业污水、食品与发酵生产的污水；供水的处理，包括江水、河水、 湖水、水库水；洗煤水絮凝；电厂冷却水软化；中水处理；生物分离，包括单细胞蛋白生产； 污泥浓缩；生态湖水净化及生物工艺澄清如，抗菌素发酵液处理等。
权利要求
1.一种微生物絮凝剂的生产方法，其包括如下步骤a)通过从污泥中筛选来确定最适宜作为微生物絮凝剂生产菌的菌种；b)微生物絮凝剂生产菌的液体培养基的配制；c)微生物絮凝剂生产菌的发酵培养；d)微生物絮凝剂粗品的制备；e)微生物絮凝剂的制备。
2.权利要求1的生产方法，其中a)步骤所确定的菌种为Galactomyces geotrichum CGMCC 2535b)步骤中所用的培养基配方为以IOOOml蒸馏水计，蔗糖18g，FeSO40. 006g, K2PO4 0. 6g, (NH4)2SO4 0. 6g, KCl 0. 3g, NaNO3 1. 8g, MgSO4 120. 3g。c)步骤包括种子液培养和发酵液培养，种子液培养条件为在29°C-37°C下培养 18h-36h，通气量为0. 5-1. OL/min，转速为190_350r/m，发酵液培养条件为在30-40°C下培养 48h，通气量为 0. 5-1. OL/min，转速为 100_350r/m。d)步骤将发酵液在6000-9000r/min下离心20-30min去除菌体，将离心分离后的液体加入3倍体积的4°C的乙醇，在4°C条件下放置12h以上，可见絮凝沉淀物产生，在4000r/ min条件下离心30min将乙醇与絮凝剂粗品沉淀分离；将离心后的固相真空干燥5_6h，真空干燥条件为温度为60°C 士2°C，真空度为0. 06MPa，获得絮凝剂粗制品。e)步骤将絮凝剂粗品溶解于无菌水中，加入3倍无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂，4000r/ min离心30min，收集沉淀，再重新溶解于蒸馏水中。将絮凝剂溶液装入MV10000透析袋里， 透析袋用0. 5mol/L EDTA煮沸处理后使用，去离子水中4°C透析24小时，每隔8小时换一次透析外液。将透析内液加入3倍无水冷乙醇再次沉淀絮凝剂，4000r/min离心30min收集沉淀，真空干燥后得絮凝剂纯品。
3.根据权利要求2的方法制得的微生物絮凝剂。
全文摘要
本发明提供了利用一种新的微生物絮凝剂生产菌Galactomyces geotrichum CGMCC NO.2535生产微生物絮凝剂的生产方法以及由此制得的微生物絮凝剂。本发明的微生物絮凝剂生产菌生产絮凝剂的方法简单，易行，发酵时间短，生产成本低；所产絮凝剂适用范围广，用量少，絮凝效率高。并且经提取生产的微生物絮凝剂无毒无害、应用无二次污染、可生物降解、可进行大规模推广应用，具有广阔的应用前景。
文档编号C02F1/52GK102311975SQ20101024680
公开日2012年1月11日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者万鹰昕 申请人:北京联合大学