富集赭曲霉毒素a的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用。该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂，是将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到的偶联物；所述赭曲霉毒素A多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备：以赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其亲和色谱柱具有浓缩待测样品中赭曲霉毒素A浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的作用。
【专利说明】富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用【技术领域】[0001]本发明涉及富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的有毒代谢产物。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素中毒性最强、产量最高的一种，对人和动物有强烈的毒害作用，可以导致动物的肾萎缩、胎儿畸形、流产、死亡，并且具有高度的致癌性。赭曲霉毒素A在大麦、小麦、燕麦、玉米等大多数谷物中存在。用受赭曲霉毒素A污染的谷物饲养的家禽也会受到污染，赭曲霉毒素A直接或间接危及人体健康。因此，赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界关注的毒素。1993年，国际癌症研究院(TheInternational Agency for Researchon Cancer)将赫曲霉毒素定为213组致癌物质(可能是人类致癌物)。各国纷纷制定了谷物中赭曲霉毒素A的限量标准，第56次FA0/WH0食品添加剂联合专家委员会会议对赭曲霉毒素A进行了危险性评价并制定了谷物食品中赭曲霉毒素A最大残留量标准为5 u g/kg，我国和欧盟及其成员国也规定在谷物中最大残留量为 5 ii g/kg。
[0003]目前赭曲霉毒素A的测定方法有多种，如:薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC/MS)、免疫学检测等方法。由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少。这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。免疫亲和层析技术是一种集免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质上是一项效率高、纯度高、快速的技术，可以使免疫检测技术(如ELISA等)和层析技术在特异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品的不足。使用免疫亲和色谱纯化富集样品中的赭曲霉毒素A，可以很大程度的提高分析结果的准确性、可靠性和分析的极限。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种高柱容量(高富集率)的赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法。
[0005]本发明所提供的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂，是将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到的偶联物(吸附剂)；
[0006]所述赭曲霉毒素A多克隆抗体可按照包括如下步骤的方法制备:以赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。
[0007]其中，所述非人哺乳动物可为兔、羊、鼠、豚鼠或马等。
[0008]上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯是赭曲霉毒素A通过N，N-二环己基碳化二亚胺(N，N’ -dieyelohexylcarbodiimide, DCC)与N-羟基琥拍酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)反应生成的活性酯。[0009]上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯可按照包括如下步骤的方法制备:
[0010]I)将碘乙酸通过 N，N- 二环己基碳化二亚胺(N，N，-di eye lohexy lcarbodiimide,DCC)与N-轻基琥拍酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)反应生成活性酯,所述活性酯为NHS-碘乙酰活性酯；
[0011]2)将所述NHS-碘乙酰活性酯与赭曲霉毒素A进行取代反应，得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
[0012]上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述I)可为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳化二亚胺在黑暗中进行缩合反应，得到NHS-碘乙酰活性酯。进一步，所述I)可为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳化二亚胺以269:695:582的摩尔比，在四氢呋喃中，20°C _25°C在黑暗中进行缩合反应，反应完毕后，以IOOOOg离心，取上清液得到NHS-碘乙酰活性酯；
[0013]所述2)可为将赭曲霉毒素A的四氢呋喃溶液与所述上清液(所述NHS-碘乙酰活性酯)混匀，在20-25°C进行取代反应，得到所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
[0014]上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体的方法包括:将所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯与所述含氨基的固相载体偶联得到的偶联物作为纯化所述赭曲霉毒素A多克隆抗体的亲和层析介质，从所述抗血清中通过亲和层析纯化得到所述赭曲霉毒素A多克隆抗体；和/或
[0015]所述亲和层析中用体积百分浓度为3%的乙酸水溶液洗脱所述赭曲霉毒素A多克隆抗。
[0016]上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述含氨基的固相载体可为含氨基的琼脂糖凝胶或为含氨基的葡聚糖凝胶；和/或，
[0017]所述载体蛋白为血兰蛋白或牛血清白蛋白。
[0018]制备上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的方法也属于本发明的保护范围。
[0019]以上述免疫亲和吸附剂为填料的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱、含有上述免疫亲和吸附剂或上述免疫亲和色谱柱的富集赭曲霉毒素A的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0020]所述试剂盒还包括上样缓冲液、漂洗液及洗脱液。所述的上样缓冲液可为PBS，所述漂洗液可为PBSt，所述的洗脱液可为乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶剂为水，溶质为乙酸和甲醇，乙酸的体积百分浓度为3%，甲醇的体积百分浓度为80%。
[0021]每升所述PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g，加蒸水定容至lOOOmL，调pH值到7.4制成。
[0022]每升所述PBSt 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g,吐温-20 500uL，加蒸水定容至IOOOmL, il pH值到7.4制成。
[0023]上述免疫亲和吸附剂、上述免疫亲和色谱柱、或上述试剂盒在富集赭曲霉毒素A中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]所述富集赭曲霉毒素A具体可为富集谷物或饲料中的赭曲霉毒素A。
[0025]上述应用中，包括如下得到用于上柱的样品溶液的步骤:
[0026]将谷物或饲料研碎并通过Imm的试验筛，不要研成粉末。称取5g (精确到0.0lg)研碎的样品于15mL离心管中，加入Ig氯化钠和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，拧好盖子，高速震荡，萃取5min ;然后4000rpm离心5min，准确移取4mL上清液于50mL的离心管中，加 PBS (每升 PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H202.9g，加蒸水定容至lOOOmL，调pH值到7.4制成)稀释至刻度，混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，得到用于上柱的样品溶液。
[0027]上述应用中，还包括将上述用于上柱的样品溶液按照如下步骤进行富集的步骤:将上述用于上柱的样品溶液过上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱，然后用所述漂洗液洗涤，再用所述洗脱液洗脱，得到富集的赭曲霉毒素A溶液。
[0028]实验证明，本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂对赭曲霉毒素A就有很高的富集率、灵敏度和回收率。对赭曲霉毒素A的富集率为52ii g/mL富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂，对赭曲霉毒素A灵敏度可以达到100ng/L，对赭曲霉毒素A的回收率达到80%以上。本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂可以高效、准确、可靠、快速简便的富集赭曲霉毒素A。装柱体积25 y L的本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂能达到现有纯化富集柱装柱体积1000 u L的容量和更敏感的富集效率。本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂可以把待检样品中赭曲霉毒素A富集起来，以便进一步应用于化学分析仪器检测(HPLC，高效液相色谱法)和胶体金测试条的快速测试。本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其亲和色谱柱具有浓缩待测样品中赭曲霉毒素A浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为用本发明的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱提纯的赭曲霉毒素A，经胶体金试纸条测试得到的效果图。
[0030]图中，A =PBS经胶体金试纸条检测结果为C、T均显色，为阴性；B:0.1ng/mL的赭曲霉毒素A溶液经胶体金试纸条检测结果为C、T均显色,为阴性；C:0.1ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为样品进行亲和层析收集的流出液(滤过液)经胶体金试纸条检测结果为C、T均显色，为阴性；D:0.1ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为样品进行亲和层析洗脱出的液体经胶体金试纸条检测结果为C显色、T不显色，为阳性。
【具体实施方式】
[0031]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]下述实施例中所用的缓冲液PBS和PBSt的配制方法如下:
[0033]每升PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g，加蒸水定容至lOOOmL, il pH值到7.4制成。
[0034]每升PBSt 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g,吐温-20500uL，加蒸水定容至lOOOmL，调pH值到7.4制成。
[0035]实施例1、制备富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂
[0036]本实施例给出了由赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到的偶联物作为富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的制备方法。该方法包括:
[0037]一、赭曲霉毒素A特异性多克隆抗体的制备
[0038]1、赭曲霉毒素A全抗原以及包被抗原的制备:
[0039]( I)赭曲霉毒素A-NHS活性酯(半抗原)的制备 [0040]I)取 50mg 碘乙酸(0.269mmol)和 80mg N-羟基玻拍酸亚胺(NHS) (0.695mmol)溶解于500uL四氢呋喃(THF)，得到溶液I ;将120mg N，N-二环己基碳化二亚胺(DCC)(0.582mmol)溶解于500uL THF，得到溶液2。将溶液I与溶液2混合，在转速为IOOrpm旋转半径为200mm的摇床在室温(25°C )黑暗中进行缩合反应30min，然后1000Og离心2min，取上清液制得NHS-碘乙酰活性酯，备用。
[0041]2).将50mg (0.124mmol)赭曲霉毒素A彻底溶解于500 y LTHF中得到赭曲霉毒素A溶液，把步骤I)的上清液(NHS-碘乙酰活性酯)加入到赭曲霉毒素A溶液中，混匀，在20°C转速为IOOrpm旋转半径为200mm的摇床上进行取代反应I小时，即得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
[0042](2)赭曲霉毒素A全抗原以及包被抗原的制备
[0043]取50mg载体蛋白一钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，溶解于5mL0.lmol/L碳酸钠溶液，使pH为8.3，加入步骤(1)的赭曲霉毒素A-NHS活性酯，混匀，室温(20-250C )于转速为IOOrpm旋转半径为200mm的摇床进行取代反应I小时。产物过脱盐柱G25S印hadex (脱盐步骤:用10倍体积蒸馏水洗涤脱盐柱，加入样品，待样品完全加入填料后，补加蒸馏水，弃掉空量体积(填料颗粒间和颗粒内的体积)，收集的流出液就是脱盐后的样品，即得到赭曲霉毒素A与载体蛋白的偶联物，作为赭曲霉毒素A全抗原,作为制备赭曲霉毒素A多克隆抗体的免疫原。将载体蛋白为KLH的赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物命名为赭曲霉毒素A-KLH，将载体蛋白为BSA的赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物命名为赭曲霉毒素A-BSA。分装保存，用于动物免疫。
[0044]2、赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备:
[0045]I)动物免疫程序:
[0046]用步骤I制备的赭曲霉毒素A-BSA溶液(用蒸懼水溶解步骤I制备的赭曲霉毒素A-BSA得到的溶液)作为疫苗免疫新西兰大白兔，疫苗中赭曲霉毒素A-BSA的浓度为lmg/mL,首次免疫每只兔用0.5mL疫苗加ImL完全佐剂混匀多点注射，加强免疫每只兔用
0.25mL疫苗加0.75mL PBS加ImL不完全佐剂混匀，分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫一次，35-40天采集血清用ELISA方法(将步骤I的赭曲霉毒素A-BSA稀释成Iug/mL，按IOOul/孔加到96孔板上，37°C静置包被Ih ;取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。加A l%BSA100ul/孔，37°C静置封闭lh，取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。按IOOul/孔加入PBS，用含0.1%BSA的PBS乳液按1:500稀释抗血清，加入50ull:500的稀释血清，混匀，取50ul加到第二孔，……依次类推，最后一孔不加抗体，作为空白对照，抗体加入后，37°C静置反应lh，取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。按IOOul/孔加入二抗，37°C静置反应0.5h，取出，用PBSt洗3次，每次都拍干。按IOOul/孔加入显色剂TMB，37°C静置反应15min，取出，按IOOul/孔加入终止液终止反应，酶标仪上0D450波长读数，以最大0D450值的1/20D值对应的稀释度作为抗体滴度)检测滴度，血清滴度达到1:6400后进行生产性血清制备。[0047]2)抗血清制备
[0048]从耳部静脉采集抗血清，20mL/只兔，血清采集后于4°C静置I小时。然后再5000g离心lOmin，收集上清液，得到抗血清(免疫血清)。
[0049]3)抗原亲和色谱填料的制备:
[0050]将步骤I的赭曲霉毒素A-NHS活性酯在pH8-9条件下直接与含氨基琼脂糖凝胶(G Bios，786-066)在50% (体积百分浓度)的丙酮水溶液中反应，室温(20-25°C )于转速为IOOrpm旋转半径为200mm的摇床进行取代反应过夜，生成赭曲霉毒素A-琼脂糖。次日用PBS将填料杂质洗去。即得到赭曲霉毒素A抗原特异性亲和色谱填料，用于分离提纯赭曲霉毒素A多克隆抗体。
[0051]4)多克隆抗体提纯
[0052]将500mL步骤2)的免疫血清流过步骤3)所制的亲和色谱填料柱。经PBSt清洗去掉杂质后，柱上的特异性抗赭曲霉毒素A抗体用体积百分浓度为3%的乙酸水溶液洗脱。洗脱的抗体用透析袋透析去掉乙酸，冻干，得到赭曲霉毒素A多克隆抗体。
[0053]二、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂制备
[0054]用50mL浓度为0.lmol/L碳酸钠溶液溶解Ig步骤一纯化的赭曲霉毒素A多克隆抗体，与40mL的含氨基琼脂糖凝胶(G Bios，786-066)在体积为90mL的玻璃层析柱室温下流式循环反应30分钟。加入50mg硼氢化钠溶解混匀后，转4°C冰箱静置30分钟，用500mLPBSt清洗后，再用IOOmL PBS清洗，自然滴干，加入等体积甘油，混匀，富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附_20°C保存备用。
[0055]取40ml上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附作为填料装入亲和层析塑料柱中，填料两头分别加上I个孔径为50 y m的筛板，筛板刚好与填料接触(不要紧压填料)后得到40ml富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附的免疫亲和色谱柱。用PBS平衡柱子，然后加入用PBS配制的50ml步骤一纯化的赭曲霉毒素A多克隆抗体溶液(含有IOOOmg赭曲霉毒素A多克隆抗体)，自然重力下流出，使柱子达到饱和状态。用PBSt清洗柱子，将未结合的抗体洗掉。应用BCA法检测过柱前后的赭曲霉毒素A多克隆抗体的含量变化，实验重复三次，计算出结合在琼脂糖上的抗体的量。
[0056]结果表明未结合的步骤一纯化的赭曲霉毒素A多克隆抗体为150mg，实际偶联的步骤一纯化的赭曲霉毒素A多克隆抗体为850mg,该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的抗体吸附量(抗体密度)平均为21.25mg/mL。
[0057]实施例2、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱及其特性检测
[0058]一、制备富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱
[0059]取25 ii L实施例1制备的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂作为填料装入容量为200 y L的亲和层析塑料柱中，填料两头分别加上I个孔径为50 的筛板，压紧后得到25 u L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱。
[0060]该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的贮藏条件:用含有0.01%叠氮钠和
0.1%BSA的磷酸缓冲液，3_8°C下保存，不能冷冻。该产品的有效期为12个月。
[0061]二、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的特性检测
[0062]该步骤所用的上样缓冲液为PBS。
[0063]该步骤所用的漂洗液为PBSt。[0064]该步骤所用的洗脱液为乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶剂为水，溶质为乙酸和甲醇，乙酸的体积百分浓度为3%，甲醇的体积百分浓度为80%。
[0065]1、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的容量测试
[0066]取按照步骤一的条件贮藏12个月的步骤一制备的25 ii L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱按照如下方法测定柱容量:将亲和色谱柱取出，室温平衡IOmin ;用5mLPBS平衡柱子，然后加入5mL用PBS配制的浓度为2ug/mL的赭曲霉毒素A标准品(Sigma,01877)，自然重力下流出，使柱子达到饱和状态(判断标准为:流出液中赭曲霉毒素A和加样液浓度相同)。再用IOmL PBS清洗亲和色谱柱，除去干扰杂质。最后加入ImL洗脱液洗脱，收集洗脱液，用HPLC法按照GB/T25220-2010检测，计算出动态柱容量(指每毫升免疫吸附剂(或柱床体积)对待测物的最大吸收值)。
[0067]三次重复实验的结果表明该25 ii L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的柱容量平均为52y g/mL填料。说明该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的富集能力很强，平均ImL的填料吸附52 U g的赭曲霉毒素A，本发明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的富集率为52ug/mL。
[0068]2、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的回收率测试
[0069]将赭曲霉毒素A标准品(sigma，01877)用上样缓冲液分别制成浓度为2ng/mL、20ng/mL、100ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品，并以上样缓冲液作为空白待测样品。按照步骤I的方法，用按照步骤一的条件贮藏12个月的步骤一制备的25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱检测待测样品中的赭曲霉毒素A的质量。
[0070]两次重复实验的结果表明:①50mL浓度为2ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品，用洗脱液洗脱出的赭曲霉毒素A分别为80.5ng、80.3ng,平均回收率为80.4% ；
[0071]②5mL浓度为20ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品,用洗脱液洗脱出的赭曲霉毒素A分别为90.2ng、89.6ng;平均回收率为89.9% ；
[0072]③ImL浓度为100ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品,用洗脱液洗脱出的赭曲霉毒素A分别为83ng、85ng，平均回收率为84%;
[0073]④空白待测样品用洗脱液洗脱，未检出赭曲霉毒素A。
[0074]说明富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱对赭曲霉毒素A的回收率达到了 80%以上。
[0075]3、极限试验
[0076]将赭曲霉毒素A标准品(sigma，01877)用上样缓冲液分别制成浓度为100ng/L、1000ng/L的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品，并以上样缓冲液作为空白待测样品。按照步骤I的方法，用按照步骤一的条件贮藏12个月的步骤一制备的25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱检测待测样品中的赭曲霉毒素A的质量。
[0077]三次重复实验的结果为:①IOmL浓度为100ng/L的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品，用洗脱液洗脱出的赭曲霉毒素A分别为1.3ng、0.9ng、1.0ng，平均为1.07ng ;@2mL浓度为1000ng/L的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品，用洗脱液洗脱出的赭曲霉毒素A分别为
2.6ng, 2.lng、2.4，平均为2.4ng;③空白待测样品用洗脱液洗脱，未检出赭曲霉毒素A。说明该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的灵敏度可以达到100ng/L，经富集浓缩后样品达到检测仪器的要求。[0078]实施例3、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱与胶体金测试条联用对待测样品进行定性测试
[0079]制备10只25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱，每只的制备方法如下:取25 ii L实施例1制备的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂作为填料装入容量为ImL的亲和层析塑料柱中，填料两头分别加上I个孔径为50 y m的筛板，压紧后得到25 y L的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱。
[0080]随机抽样5只25ii L富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱，室温平衡IOmin ;用5mL PBS平衡柱子，备用。将赭曲霉毒素A标准品(sigma，01877)用PBS分别制成浓度为
0.0Ing/mL,0.1ng/mL、1.0ng/mLU0.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为待测样品，并以PBS作为空白待测样品，按照下述方法进行亲和层析。将ImL上述待测样品分别上柱，控制流速为
0.05mL/s，收集流出液(滤过液)。上样完毕，用PBS平衡，然后以100 y L体积百分浓度为3%的乙酸水溶液(用饱和tris-base溶液中和到pH=7.0-7.5)作为洗脱液进行洗脱收集洗脱出的液体IOOuL0
[0081]用敏感度5ng/mL的赭曲霉毒素A胶体金测试条(无锡安迪生物工程有限公司，AN-OO3)按照试剂盒的说明书检测上述0.01ng/mL、0.1ng/mL、1.0ng/mL和10.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液和PBS、各个待测样品的流出液、各个待测样品洗脱出的液体。测试结果表明，胶体金测试条对0.01ng/mL、0.1ng/mL和1.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液和PBS检测结果为阴性，对10.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液的检测结果为阳性，说明胶体金测试条合乎产品特性。胶体金测试条对所有5种样品过柱后的滤过液皆呈阴性。说明该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱能有效俘获赭曲霉毒素A分子。
[0082]胶体金测试条对上样缓冲液PBS和0.0lng/mL赭曲霉毒素A溶液作为样品进行上述亲和层析洗脱出的液体的检测结果为阴性，对0.lng/mL、l.0ng/mL、10.0ng/mL的赭曲霉毒素A溶液作为样品进行上述亲和层析洗脱出的液体的检测结果为阳性，结果见图1，说明:1)该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱上的抗体稳定，没有脱落，不造成因抗体不稳定脱落的假阳性。2)该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱能起富集作用，ImL的0.1ng/mL的样品原液阴性(低于胶体金测试条的检出限)，经过该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱纯化富集到IOOy L后，可以被捡胶体金测试条检测出来。说明经过本发明的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱富集后，检测下限可达0.1ng/mL。
[0083]实施例4、富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱的使用方法
[0084]该实施例中的漂洗液为PBSt，所述洗脱液为乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶剂为水，溶质为乙酸和甲醇，乙酸的体积百分浓度为3%，甲醇的体积百分浓度为80%。
[0085]a)样品的前处理:
[0086]谷物/饲料样品:将样品研碎并通过Imm的试验筛，不要研成粉末。称取5g(精确到0.0lg)研碎的样品于15mL离心管中，加入Ig氯化钠和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，拧好盖子，高速震荡，萃取5min ;然后4000rpm离心5min，准确移取4mL上清液于50mL的离心管中，加PBSdf PH值到7.4制成稀释至刻度，混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，得到用于上柱的样品溶液共计10mL。
[0087]b).将实施例2制备的g集赫曲霉毒素A的免疫未和色谱柱从4 C冰箱移到室温(22-25°C)，平衡IOmin后，取出上方塞子，并拔掉下方堵头，用2mL PBS洗涤2次。
[0088]c).用0.2mL的洗脱液洗涤经过步骤b)处理的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱，洗掉填料上残留的赭曲霉毒素A抗体，待洗脱液流干后用PBS洗至中性。
[0089]d).将步骤a)所得的样品溶液过柱，流速控制在0.05mL/s。
[0090]e).待液体完全排干后，用漂洗液洗涤2次，每次2mL。
[0091]f).待液体完全排干后，用洗脱液进行洗脱，洗脱出的液体可直接用于HPLC检测分析，或者将洗脱出的液体用氮气吹干后用复溶液(10%甲醇-0.5%BSA-PBSt)将残渣溶解，该溶解物可以用于ELISA测试盒和胶体金试纸条测试。其中，复溶液的成分为在PBSt溶液中加入甲醇和BSA至甲醇体积含量为10%，BSA含量为0.5%得到的液体。
[0092]实施例5、实施例2的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱检测含赭曲霉毒素A的玉米
[0093]a)取不含赭曲霉毒素A的玉米籽粒研碎并通过Imm的试验筛，不要研成粉末。称取5g(精确到0.0lg)研碎的样品于15mL离心管中，添加赭曲霉毒素A标准品(sigma, 01877),使样品中赭曲霉毒素A的含量为0.lng/g，加入Ig氯化钠和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，拧好盖子，高速震荡，萃取5min ;然后4000rpm离心5min，准确移取4mL上清液于50mL的离心管中，加PBS稀释至刻度，混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，得到用于上柱的样品溶液。
[0094]b).将实施例2制备的g集赫曲霉毒素A的免疫未和色谱柱从4 C冰箱移到室温(22-25°C)，平衡IOmin后，取出上方塞子，并拔掉下方堵头，用2mL PBS洗涤2次。
[0095]c).用0.2mL的洗脱液洗涤经过步骤b)处理的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱，洗掉填料上残留的赭曲霉毒素A抗体，待洗脱液流干后用PBS洗至中性。
[0096]d).将步骤a)所得的样品溶液过柱,流速控制在0.05mL/s。
[0097]e).待液体完全排干后，用漂洗液(同实施例4)洗涤2次，每次2mL。
[0098]f).待液体完全排干后，用洗脱液(同实施例4)进行洗脱，得到富集的赭曲霉毒素A溶液。
[0099]g).应用国标检测方法:GB/T25220-2010粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法和荧光光度法对样品中赭曲霉毒素A的含量进行测定。
【权利要求】
1.制备富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的方法,包括将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的步骤； 所述赭曲霉毒素A多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备:以赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯是赭曲霉毒素A通过N，N- 二环己基碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺形成的活性酯。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯按照包括如下步骤的方法制备: 1)将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳化二亚胺在黑暗中进行缩合反应，得到NHS-碘乙酰活性酯； 2)将所述NHS-碘乙酰活性酯与赭曲霉毒素A进行取代反应,得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述I)为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳化二亚胺以269:695:582的摩尔比，在四氢呋喃中，20°C_25°C在黑暗中进行缩合反应，反应完毕后，以IOOOOg离心，取上清液得到NHS-碘乙酰活性酯； 所述2)为将赭曲霉毒素A的四氢呋喃溶液与所述上清液混匀,在20-25°C进行取代反应，得到所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体的方法包括:将所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯与所述含氨基的固相载体偶联得到的偶联物作为纯化所述赭曲霉毒素A多克隆抗的亲和层析介质，从所述抗血清中通过亲和层析纯化得到所述赭曲霉毒素A多克隆抗体；和/或 所述亲和层析中用体积百分浓度为3%的乙酸水溶液洗脱所述赭曲霉毒素A多克隆抗体。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述含氨基的固相载体为含氨基的琼脂糖凝胶或为含氨基的葡聚糖凝胶；和/或， 所述载体蛋白为血兰蛋白或牛血清白蛋白。
7.由权利要求1-6中任一所述的方法制备的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂。
8.以权利要求7所述的免疫亲和吸附剂为填料的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱。
9.含有权利要求7所述的免疫亲和吸附剂或权利要求8所述的免疫亲和色谱柱的富集赭曲霉毒素A的试剂盒。
10.权利要求7所述的免疫亲和吸附剂，权利要求8所述的免疫亲和色谱柱、或权利要求9所述的试剂盒在富集赭曲霉毒素A中的应用。
【文档编号】B01J20/24GK103480340SQ201310411949
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】周晓, 李川山, 谢军, 李炜, 韦素梅, 刘运龙, 谢体三, 萧浩, 徐德林, 林丰, 林丹超 申请人:广西壮族自治区粮油科学研究所