本发明属于纳米微球制备、官能团化及其在中药活性成分分离中应用的技术领域，涉及一种石蒜碱表面分子印迹纳米微球的制备及利用该纳米材料为固相萃取剂分离、纯化天然产物中的石蒜碱。
背景技术：
石蒜碱是传统药用植物石蒜科(Amaryllidaceae)中的生物碱成分。生物活性研究表明，石蒜碱及其衍生物具有抗炎、抗病毒、抗疟疾、抑制乙酰胆碱酯酶、保护心血管以及诱导肿瘤细胞凋亡等多种作用。[参见(a)A.Jimenez，A.Santos，G.Alonso and D.Vazquez.Biochim.Biophys.Acta(BBA)：NucleicAcidsProteinSynth.1976，425，342-348.(b)Y.Toriizuka，E.Kinoshita，N.Kogure，M.Kitajima，A.Ishiyama，K.Otoguro，H.Yamada，S.Omura and H.Takayama.Bioorgan.Med.Chem.2008，16，10182-10189.(c)J.Liu，Y.Yang，Y.Xu，C.Ma，C.Qin and L.Zhang.Virol.J.2011，8，483-491.]
植物提取液、各种中药复方及生物样品成分十分复杂。为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，对中草药活性成分分离提取是至关重要的。目前对中草药样品前处理技术的研究也比较多，主要集中在固相萃取、液相萃取、超临界流体萃取、超滤离心和微波萃取等。其中固相萃取技术由于操作简单、快速、使用有机溶剂少、成本低、对环境的二次污染少等优点，已经成为目前中草药中活性成分提取和富集的主要技术手段。固相萃取的性能通常与其填料的特性紧密相关。硅胶柱、C18键合相柱、Al2O3柱发展较早，其普适性较强，对大多数化合物有比较好的富集，应用比较广泛。但最大缺点是选择性差，富集容量低[参见：王洪允，江骥，胡蓓，等.固相萃取技术进展及在生物药物分析中的应用[J].药物分析杂志，2003，23(3)，236]。分子印迹材料是为模板分子量身定做的高分子聚合物或者纳米材料，由于其经洗脱模板分子后，能留下在形状、大小以及识别位点都与模板分子相匹配的空穴，该空穴能重新识别模板分子，由于其兼有高效、稳定和特异选择性且制备价格低廉的特点，因而具有较广泛应用前景。然而目前广泛使用的分子印迹材料为整体印迹聚合物，具有包括低吸附能力低、不能完全成为模板以及不易洗脱等明显的缺陷。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种以石蒜碱为模板的表面分子印迹纳米微球为新型吸附分离材料，并以此作为固相萃取柱的固定相从中药粗提物中定向分离、富集、纯化石蒜碱的方法，由此可以获得高提取率的目标成分。本发明通过以下的技术方案实现的。
采用的技术方案：
一种石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱，所述的固相萃取柱的基质为石蒜碱表面分子印迹纳米微球，石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的SiO2纳米微球表面进行聚合反应制得，固相萃取柱空管容积为1～6mL，填装高度为0.6～1.2cm，空管材质为聚烯烃。
1.石蒜碱表面分子印迹纳米微球的制备：
(1)SiO2纳米微球的制备：乙醇、氨水按照1∶2～2∶1的比例在圆底烧瓶中混合均匀，总体积控制在50～200mL，然后正硅酸四乙酯(TEOS)5～15mL、乙醇60～120mL迅速加入上述溶液中。混合后的溶液在室温下继续反应2～5h。反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的SiO2纳米微球；
(2)SiO2纳米微球的乙烯基化：将按照上述方案制得的SiO2纳米微球0.3～1.5g添加到40～150mL甲苯溶液中分散混合，然后在溶液中加入3-(甲基丙烯酰氧基)丙基-三甲氧基硅烷(KH-570)2～8mL，混合后的溶液在氮气保护下80～95℃下反应8～15h，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的乙烯基化的SiO2纳米微球；
(3)以石蒜碱为模板的表面分子印迹纳米微球的制备：石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的SiO2纳米微球表面进行聚合反应制得，具体步骤如下：20～40mg的石蒜碱、30～60mg的丙烯酰胺及500～1000mg乙二醇二甲基丙烯酸酯溶解于40～100mL的乙腈中，然后乙烯基化的SiO2纳米微球50～120mg也添加入上述溶液中超声分散，加入5～20mg的偶氮二异丁腈，通氮气20～60min。最后，在恒温振荡下，进行两步聚合反应。第一步在40～50℃反应6～7h，完毕后进行第二步聚合反应，第二步在50～60℃反应20～24h。反应获得的产品离心，同时用大量的乙醇洗涤多次去除表面未反应的化学试剂，在分子印迹纳米微球中残存的模板分子用甲醇/冰醋酸(比例为6∶1～1∶1)洗去，最后制得的表面分子印迹微球用大量的甲醇洗去，40～60℃真空干燥，获得石蒜碱表面分子印迹纳米微球。
2.石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱制备：
(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；
(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的石蒜碱表面分子印迹纳米微球干法填装入柱内；
(3)在填装的石蒜碱表面分子印迹纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.6～1.2cm，制备得到固相萃取柱。
3.固相萃取分离纯化植物提取液中的石蒜碱：在进行固相萃取之前，首先用(5～20)mL甲醇、乙睛或者相应的缓冲溶液活化表面分子印迹纳米微球，然后在真空泵负压驱动下使植物提取液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液乙腈/甲醇等把分析物洗脱收集到容器中，然后进行定性、定量分析。
与现有的固相萃取柱相比，本发明所提供的石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱具有以下优点：
(1)选择性好，柱容量高，达到6.68μmol/g。
(2)环境友好：本发明的石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱本身是环境友好的，并且在萃取过程中，只需消耗极少量的有机溶剂，不会引入其他有毒有害物质；
(3)在完成发明的过程中，选择文殊兰中石蒜碱作为研究目标物，对所述固相萃取柱的各项性能指标进行了反复测试。结果表明对于上述生物碱的加标回收率均能达到92％-105％，解吸过程筛单，2mL的甲醇就可将上述物质洗脱下来。
附图说明
图1为石蒜碱表面分子印迹纳米微球合成示意图及应用于固相萃取植物提取液中石蒜碱示意图；
图2为石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱示意图，图中为：固相萃取柱管1、上筛板2、下筛板3、石蒜碱表面分子印迹纳米微球填料4；
图3为合成得到的原始SiO2纳米微球及石蒜碱表面分子印迹纳米微球透射电镜图(TEM)。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取填料的制备
实验材料：丙烯酰胺，批号为：A108465，购自上海阿拉丁试剂有限公司；偶氮二异丁腈，批号为A104256，购自上海阿拉丁试剂有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯，批号为：E106223，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硅酸四乙酯，批号为：L1306074，购自上海阿拉丁试剂有限公司；3-(甲基丙烯酰氧基)丙基-三甲氧基硅烷，批号为：N136609，购自上海阿拉丁试剂有限公司；盐酸石蒜碱，批号为：L101559，购自上海阿拉丁试剂有限公司；甲苯，批号为X112054，上海阿拉丁试剂有限公司。
实验仪器及设备：圆底烧瓶、KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、DF-101S磁力加热搅拌器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
(1)原始SiO2纳米微球的制备
乙醇、氨水按照3∶5的比例在圆底烧瓶中混合均匀，总体积控制在100mL，然后正硅酸四乙酯(TEOS)10mL、乙醇90mL迅速加入上述溶液中。混合后的溶液在室温下继续反应3h。反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的SiO2纳米微球。将所得产品晶形电镜表征，如图3A所示。
(2)以石蒜碱为模板的表面分子印迹纳米微球的制备
将制得的SiO2纳米微球0.5g添加到50mL甲苯溶液中分散混合，然后在溶液中加入3-(甲基丙烯酰氧基)-丙基-三甲氧基硅烷(KH-570)2mL，混合后的溶液在氮气保护下90℃下反应12h，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的乙烯基化的SiO2纳米微球。石蒜碱表面分子印迹纳米微球是通过在乙烯基化的SiO2纳米微球表面进行聚合反应制得，具体步骤如下：28.7mg的石蒜碱、56.8mg的丙烯酰胺及634mg乙二醇二甲基丙烯酸酯溶解于50mL的乙腈中，乙烯基化的SiO2纳米微球100mg也添加入上述溶液中超声分散，然后加入10mg的偶氮二异丁腈，通氮气30min。最后，在恒温振荡下，进行两步聚合反应。第一步在50℃反应6h，完毕后进行第二步聚合反应，第二步在60℃反应24h。反应获得的产品离心，同时用大量的乙醇洗涤多次去除表面未反应的化学试剂，在表面分子印迹纳米微球中残存的模板分子用甲醇/冰醋酸(比例为4∶1)洗去，最后制得的表面分子印迹微球用大量的甲醇洗去，50℃真空干燥，获得石蒜碱表面分子印迹纳米微球。
实施例2：石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱的制备
1、空柱材料和规格
现有的固相萃取小柱空柱规格从1～6mL不等。空柱材料为聚丙烯，小柱上下各有20μm孔径的聚乙烯筛板，上述空柱均可使用于本发明中。在下面的实验例中本发明采用3mL的规格。
2、固相萃取柱的填料
固相萃取柱的填料为石蒜碱表面分子印迹纳米微球。
3、填装量和填装高度的选择
用前述制备的石蒜碱表面分子印迹纳米微球填装3mL固相萃取柱，如附图2，将一片多孔性聚乙烯下筛板3置于固相萃取柱管1底部，称取相当于固相萃取柱空管容积二分之一的石蒜碱表面分子印迹纳米微球填料4放入固相萃取柱管1中，然后将多孔性上筛板2放在填料上部，压紧填料使填装柱高度保持在0.8cm，得到石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱。
实施例3：固相萃取分离纯化文殊兰提取液中的石蒜碱
实验材料：盐酸石蒜碱，批号为：L101559，购自上海阿拉丁试剂有限公司，乙酸铵购自上海上海阿拉丁试剂有限公司，批号为：20070622；高效液相色谱纯乙腈购自Merck公司，批号：1605030-138；文殊兰，购自南京同仁堂药业有限公司。
实验仪器和设备：Waters公司2695/2996高效液相色谱仪、AP-01P真空泵、按述实施例2中制备的石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱。
实验过程：
取文殊兰粉末20g，加入95％乙醇溶液200mL于圆底烧瓶中，在84℃加热回流2.5h，共3次，过滤即得文殊兰粗提物，粗提物用乙腈稀释不同倍数。将制得的石蒜碱表面分子印迹纳米微球固相萃取柱用4mL乙腈完全浸润填料保持5min，然后以1滴/s的速度放掉液体，处理完后小柱处于活化状态；搭好装置，开真空泵，调好真空度，以2mL/min的速度取(20～100)mL样品流过萃取柱，抽滤除去溶剂成分，再用甲醇/乙腈(90∶10)洗脱固相萃取柱，可以得到不同富集倍数的洗脱液，用高效液相色谱仪进行分析检测及定量分析，经浓缩、干燥得到石蒜碱7.2mg。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。