纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化酶的制作方法

本发明涉及纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化酶，属于纳米技术和仿生技术领域。

背景技术：

天然酶因其催化效率高、专一性强、反应条件温和而受到广泛的关注和应用。然而天然酶易受到多种物理、化学因素的影响而失去活性，并且还具有来源有限，提纯困难，价格昂贵等缺点，极大地限制了它们的应用。近年来，四氧化三铁等一些纳米材料模拟过氧化物酶的发现，使得纳米材料在生物催化领域的应用受到了广泛关注。纳米人工模拟酶具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势，在模拟生物酶方面显示出极其诱人的应用前景。

目前，已报道的纳米人工模拟酶主要为针对显色或发光底物的过氧化物酶和氧化酶，以及与活性氧相关的过氧化氢酶、超氧化歧化酶等。研究开发具有其它特定模拟酶特性的纳米仿生催化材料具有重要的意义和广泛的应用前景。

本发明提供了一种具有良好的模拟半胱氨酸氧化酶的纳米氧化铜仿生催化材料及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种具有良好的模拟半胱氨酸氧化酶的纳米氧化铜仿生催化材料及其制备方法。

为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案：本发明所述的一种纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化物酶，其特征是纳米氧化铜具有半胱氨酸氧化酶特性，其催化氧气氧化半胱氨酸生成胱氨酸和过氧化氢。

所述的纳米氧化铜由以下方法制备的:取0.02mol/l的醋酸铜溶液150ml和0.5ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；快速加入0.04g/ml的氢氧化钠溶液10ml，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，纳米氧化铜粉体。

所述的一种纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化物酶，其特征是在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸，0.05ml浓度为560mg/l的纳米氧化铜和3.45ml浓度为200mm的ph为7.0的磷酸盐缓冲液，于30摄氏度水浴锅中反应10min后，加入0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，产物的最大吸收峰为333nm。

所述的一种纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化物酶，其特征是在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸，0.05ml浓度为560mg/l的纳米氧化铜和3.45ml浓度为200mm的ph为7.0的磷酸盐缓冲液，于30摄氏度水浴锅中反应0.01—10min后，加入0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定333nm处的吸光度，随着反应时间延长，胱氨酸转化率逐渐增大，180s达到完全转化。

所述的一种纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化物酶，其特征是在除氧的情况下，半胱氨酸转变为胱氨酸的速度下降。

所述的一种纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化物酶，其特征是将0.5ml浓度为20mm的对苯二甲酸，0.5ml浓度为1.5mm的半胱氨酸和0.05ml浓度为560mg/l的纳米氧化铜加入到2.95ml浓度为200mm的ph为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65℃温浴，10分钟后在紫外灯下观察，反应产物具有蓝色荧光。

所述的一种纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化物酶，其特征是将0.5ml浓度为20mm的对苯二甲酸，0.5ml浓度为1.5mm的半胱氨酸和0.05ml浓度为560mg/l的纳米氧化铜加入到2.95ml浓度为200mm的ph为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65℃温浴10分钟，反应产物最大荧光波长为421nm。

本发明的技术方案具体步骤如下：

（一）纳米氧化铜的制备：

取醋酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑色氧化铜。将反应得到的黑色氧化铜立即离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕色纳米氧化铜胶体溶液。

纳米氧化铜制备步骤如下：

（1）取0.02mol/l的醋酸铜溶液150ml和0.5ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；

（2）快速加入0.04g/ml的氢氧化钠溶液10ml,加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；

（3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。

（二）纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化酶活性

在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸,0.05ml浓度为560mg/l的纳米氧化铜和3.45ml浓度为200mm磷酸盐缓冲液（ph7.0），于30摄氏度水浴锅中反应后，加入0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定吸光度。

本发明的优点：

（1）本发明纳米氧化铜具有良好的半胱氨酸氧化酶活性，可催化氧气氧化半胱氨酸生成过氧化氢和胱氨酸。

（2）本发明所使用的纳米氧化铜制备过程简单快速。

（3）本发明纳米氧化铜模拟半胱氨酸氧化酶，可实现半胱氨酸快速转化为胱氨酸以及氧气快速转化为过氧化氢。

附图说明

图1为半胱氨酸衍生物的紫外可见吸收光谱图。

图2为胱氨酸衍生物的紫外可见吸收光谱图。

图3为纳米氧化铜催化半胱氨酸氧化的紫外可见吸收光谱图。

图4为纳米氧化铜催化半胱氨酸氧化的动力学曲线图。

图5为氮气除氧条件下纳米氧化铜催化半胱氨酸氧化的紫外可见吸收光谱图。

图6为半胱氨酸-纳米氧化铜-对苯二甲酸反应体系产物在紫外灯下的照片图。

图7为半胱氨酸-纳米氧化铜-对苯二甲酸反应体系产物的荧光光谱图。

具体实施方式

实例1：

纳米氧化铜制备:（1）取0.02mol/l的醋酸铜溶液150ml和0.5ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；（2）快速加入0.04g/ml的氢氧化钠溶液10ml,加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；（3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，纳米氧化铜粉体。

实例2：

在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸，3.5ml浓度为200mm的磷酸盐缓冲液（ph7.0）和0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定紫外可见吸收光谱。如图1所示，半胱氨酸衍生物的最大吸收峰为280nm。

实例3：

在ep管中加入0.5ml浓度为2mm胱氨酸，3.5ml浓度为200mm的磷酸盐缓冲液（ph7.0）和0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定紫外可见吸收光谱。如图2所示，胱氨酸衍生物的最大吸收峰为333nm。

实例4：

在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸，0.05ml浓度为560mg/l的实例1制得的纳米氧化铜和3.45ml浓度为200mm的磷酸盐缓冲液（ph7.0），于30摄氏度水浴锅中反应10min后，加入0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定紫外可见吸收光谱。如图3所示，产物的最大吸收峰为333nm，表明半胱氨酸被氧化生成了胱氨酸。

实例5：

在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸，0.05ml浓度为560mg/l的实例1制得的纳米氧化铜和3.45ml浓度为200mm的磷酸盐缓冲液（ph7.0），于30摄氏度水浴锅中反应不同时间后（0.01—600s），加入0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定333nm处的吸光度，根据胱氨酸的标准曲线计算胱氨酸浓度。如图4所示，随着反应时间延长，半胱氨酸逐渐转变为胱氨酸，180s完全转化为胱氨酸。

实例6：

在ep管中加入0.5ml浓度为2mm半胱氨酸，0.05ml浓度为560mg/l的实例1制得的纳米氧化铜和3.45ml浓度为200mm的磷酸盐缓冲液（ph7.0），在氮气除氧的条件下于30摄氏度水浴锅中反应10min后，加入0.5ml含有浓度为40mm邻苯二甲醛和2mg/l3-巯基丙酸的衍生化试剂，30摄氏度水浴30s后，测定紫外可见吸收光谱。如图5所示，在除氧的情况下，半胱氨酸只有部分转变为胱氨酸，说明半胱氨酸的氧化速度下降，氧气参与了纳米氧化铜催化半胱氨酸氧化的反应。

实例7：

将0.5ml浓度为20mm的对苯二甲酸，0.5ml浓度为1.5mm的半胱氨酸和0.05ml浓度为560mg/l的实例1制得的纳米氧化铜加入到2.95ml浓度为200mm的ph为7的磷酸盐缓冲液中，混合摇匀后置于65℃温浴，10分钟后在紫外灯下观察，并用荧光分光光度计测定荧光光谱（激发波长为315nm）。如图6、7所示，反应产物具有蓝色荧光，最大荧光波长为421nm，说明纳米氧化铜催化半胱氨酸氧化生成了过氧化氢。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。