专利名称：早期检测sars病毒感染的方法和试剂盒的制作方法
所属领域本发明涉及检测临床样品中严重急性呼吸综合症的病原体——SARS病毒存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术早期诊断SARS病毒感染的方法及所使用的试剂盒。
背景技术：
严重急性呼吸综合症(SARS)是因感染冠状病毒的任何一种新型变异体而引起的致死性传染病。2002年底在中国广东省部分地区首先发现，3个月内即很快传播到世界二十五个国家和地区以及中国其他许多省市，累计报告病例数达8202人，其中725人死亡。该病毒传染性强，严重危害人民群众的健康和生命。病人起病急，抗生素治疗往往无效。在人群中传播率高，容易导致疫情爆发且死亡率较高。
目前，世界卫生组织(WHO)认可的SARS病毒实验室检测技术主要有三种一是酶联免疫吸附法(ELISA)，该方法能够可靠地检出血清中抗体的存在，但需在发现症状21天后才能得到比较可靠的检测结果，因此很难用于早期诊断。二是免疫荧光法(IFA)，此方法一般在感染后10天才能检测到抗体，而且需要固定SARS病毒，并须由经验丰富的技术人员使用免疫荧光显微镜完成。以上两种方法均需测定并比较急性期和恢复期的血清抗体滴度，时间跨度长，不利于病人的早期诊断和治疗。第三种是反转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)，该方法通过检测病人发病后10天内的呼吸道分泌物或排泄物等样本中SARS病毒的RNA片段来实现早期诊断。RT-PCR方法是目前所有应用于SARS感染诊断的多种方法中最为早期、便捷和特异的方法，其对早期快速诊断SARS，挽救病人生命和防止疾病传播起到了很大作用。
实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了很小拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，将该技术应用于SARS病毒的所有已知变异体之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。
发明的目的本发明的一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测样品中SARS病毒的方法，该方法包括(1)提供包括样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系在内的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多聚核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后，根据循环反应中产生的荧光量结合定量标准曲线确定靶多核苷酸的存在及其相对量(即靶核酸序列的拷贝数)；其中核酸扩增系统包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光实时监测系统包括一个可与靶多核苷酸特异性结合的寡核苷酸探针；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ IDNO1)和5’-aag ctt ctg ggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探针是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3’(SEQ IDNO3)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的样品是可疑SARS病毒感染者的临床样品。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的SARS病毒选自SARS病毒的任何一种已知的变异体。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶多核苷酸来自SARS病毒。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸扩增系统是聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是大约重复35次的聚合酶链反应循环。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b)2’-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光实时检测体系包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的方法进一步包括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶多核苷酸的量。
本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中SARS病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有浓缩液、RNA提取液A、RNA提取液B、逆转录酶反应体系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水(DEPC H2O)、PCR扩增反应液I、PCR扩增反应液II、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和RNA阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
根据本发明的一个优选实施方案，其中浓缩液用于浓缩液态待检样品(使样品中的病毒颗粒吸附在一起并快速沉淀)。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中稀释液用于稀释定量阳性标准品。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和逆向引物分别是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aagctt ctg ggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3(SEQ ID NO3)’。
图1显示Std curve窗口下的标准曲线图2显示强中弱三个阳性标本曲线图3显示阴性标本曲线发明的详细内容本发明涉及实时定量荧光PCR方法及试剂盒，特别是涉及实时定量荧光聚合酶链反应方法及其试剂盒在SARS病毒感染的早期实验室诊断中的应用。
本发明提供了一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中SARS病毒存在的方法，该方法包括(1)提供包括SARS病毒基因组核酸的样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光检测体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸探针；特征在于所说的扩增反应中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是5’-gacgag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aag ctt ctg ggc cag ttcct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探针是5’-caa aat gaa agagct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。
与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。如众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。
与通常的实时定量荧光PCR技术相似，本发明的检测样品中SARS病毒基因组双链靶多核苷酸存在的方法中同样包括(1)提供包括(a)待检样品(b)耐热DNA聚合酶和(c)2′-脱氧核苷三磷酸(dNTP)的扩增反应体系，以及包括(a)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(b)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(c)能够与双链靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针的荧光检测体系；(2)通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；(3)退火后使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产生荧光信号；(4)检测并确定荧光发生基团所产生的荧光量；(5)分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测靶多核苷酸的存在；特征在于其中所说的靶多核苷酸是SARS病毒基因组多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aag ctt ctg ggccag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探针是5’-caa aatgaa aga gct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。
如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有SARS病毒变异体，并能够准确有效地将SARS病毒感染与甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等其他常见呼吸道病毒感染鉴别开，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件对已知的所有16个SARS病毒变异体的基因组核苷酸序列进行同源性比较并找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer Express 3)具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物15’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(20mrs)(SEQ ID NO1)和引物25’-aag ctt ctg ggc cag ttc ct-3’(20mrs)(SEQ ID NO2)；以及具有下示序列的寡核苷酸探针5’-caa aat gaa agagct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。引物所对应的扩增区段相当于SARS病毒变异株TOR2的RNA聚合酶编码序列的保守区，长度为85bp。其中，引物1互补于病毒基因组的第28382-28400位核苷酸；引物2互补于病毒基因组的第28447-28466位核苷试剂盒酸。探针则互补与第28404-28432位核苷酸。由于所设计的这些引物和探针均具有互补于病毒基因组保守区的序列，而且与其他呼吸道病毒的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以大大减少甚至避免了SARS病毒检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。
可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和FPLC层析法纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报道基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联并作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。
使用常规RNA提取方法或市售的RNA提取试剂盒，从得自受试者的嗽口液样品中提取RNA，然后使用逆转录反应体系(在每微升由250mM Tris-HCL(pH8.0)、250mM KCL、20mM MgCL2和50mM DTT的缓冲液中含有50单位mMLV酶和1单位RNA酶)将所提取的RNA转化成cDNA并将此逆转录产物用于继后的PCR扩增。
在含有引物1和2(各25pmol)、DNA模板(PCR扩增靶序列)、dNTP(10mM)、耐热DNA聚合酶(Taqman)、PCR缓冲液和水的反应体系中，使用ABI 5700型或其他结构类型的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的cDNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是93℃预变性2分钟后，首先按93℃，15秒→55℃，15秒→72℃，20秒完成10次循环，然后再按93℃，15秒→58℃，30秒条件共进行35次循环。
反应完成后，借助装置上配置的自动分析系统分析结果。在本研究中，如果循环阈(Ct)值等于或大于35，结果即为阴性；如果Ct值小于35，结果则为阳性。其中以反应的前15个循环所产生的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。一般说来，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。因为在扩增反应的Ct值之前的阶段，扩增系统中的酶、引物、探针和dNTPs均大大过量，而且系统的p值和离子浓度等也相对稳定，此时扩增反应的效率是一个与模板数无关的饱和定值。与Ct值相关的只有起始模板数(多聚核苷酸样品的拷贝数)和与样品无关的PCR系统效率。
可利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对数为横坐标，以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)，本发明的方法还进一步包括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。
本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中SARS病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有浓缩液、RNA提取液A、RNA提取液B、逆转录酶反应体系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水(DEPC H2O)、PCR扩增反应液I、PCR扩增反应液II、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和RNA阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
根据本发明的一个优选实施方案，其中浓缩液用于浓缩液态待检样品。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中稀释液用于稀释阳性定量标准品。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和逆向引物分别是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aagctt ctg ggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)。
根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3(SEQ ID NO3)’。
可按照如上所描述的和试剂盒中所附使用说明书中指出的方法使用本发明的试剂盒。
如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有16个SARS病毒变异体，并能够准确有效地将SARS病毒感染与甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等其他常见呼吸道病毒感染鉴别开，本发明基于对这些变异体和相关病毒基因组核苷酸序列的同源性比较，特别设计了适用本发明试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的实时定量检测，大大减小了SARS病毒多核苷酸检测的假阳性和假阴性。我们的实验证明，检测SARS病毒基因组核苷酸的精确度几乎为100％，灵敏度达到8×102个拷贝/ml。
值得特别说明的是，为了确保本发明的SARS病毒检测方法的准确性，我们还使用了根据已知的SARS病毒RNA序列合成的，并且在PCR扩增区域(83bp)以外向两端延伸的RNA序列(108bp)作为RNA阳性标准品(A和B)。并且，还使用携带有SARS病毒核苷酸(cDNA)序列的重组质粒作为DNA定量检测标准品。借助这些额外标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性，并作为生产本发明试剂盒的附加的质量控制标准。
另外，由于本发明试剂盒的扩增反应条件中所采用的退火温度为58℃，距离预定的实际退火温度66.2℃相差达8.2℃。所以，即使样品中的靶核苷酸只有单个核苷酸的变异，也足以保证荧光探针与在靶核苷酸上的结合和荧光信号的产生和释放。
实施例(1)制备包括下列组成成分的试剂盒浓缩液(5ml/1瓶)、RNA提取液A(100μl/管)、RNA提取液B(4ml/瓶)、逆转录酶系(20μl/1管)、DEPC H2O(2.0ml/管)、PCR反应液I(180μl/管)、PCR反应液II(10管)、稀释液(0.5ml/管)、阴性对照标本(50μl/管)、强阳性标准品(2×105基因拷贝/μl；10μl/管)、RNA阳性对照品。
(2)标本采集、运送和保存使用采样液(约5ml无菌生理盐水)充分漱口，然后将嗽口液通过漏斗样纸杯收集到无菌塑料试管中并置于低温冰箱(-70℃)中冷冻保存。如集中检验，标本需在0℃以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
(3)检测和结果首先处理标本、RNA阳性对照品和阴性对照标准品。将每份RNA阳性对照品、标本和阴性对照品分别加入到新的经高压灭菌处理过的1.5ml离心管中。向离心管加入500μl浓缩液，-20℃静置10分钟后，4℃ 12000离心10分钟。离心后，弃去上清并留下残液20～30ul。向残留液体中加入10μl的RNA提取液A，再加入400μl的RNA提取液B并混合均匀。室温放置5分钟后低速离心1分钟，小心吸去上清，用75％的预冷乙醇洗沉淀，共洗两次。然后65℃干燥沉淀。
然后，在逆转录酶(2μl)的存在下将吸附在沉淀上的RNA逆转录成c-DNA。逆转录反应后，吸取5μl逆转录产物做PCR反应。
将强阳性标准品6000rpm离心数秒，加入稀释液90μl，充分混匀后标示为105。然后另取3支灭菌新0.5ml离心管，对标准品依次进行10倍梯度稀释(分别标示为104、103、102)，-20℃保存备用。
然后分别取标本(每份5ul)和同体积的定量标准品及阴性对照，加样进PCR反应体系中并进行PCR扩增。PCR循环条件是93℃→2分钟预变性，然后按93℃ 15秒→55℃ 15秒→72℃ 20秒，先做10个循环，最后按93℃15秒→58℃ 30秒，做35个循环。
反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节分析参数使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线图达到最佳(即相关性correlation数值＜-0.95)(参见图1)。由图2和图3可分别看出，阳性标本的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，而阴性标本的荧光曲线低于阈值。最后仪器自动分析计算出的未知标本数值(Qty)。标本的SARS病毒RNA含量(基因拷贝数/ml)＝8×(Qty)。
序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>早期检测SARS病毒感染的方法和试剂盒<140>
<141>
<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1gacgagttcg tggtggtgac<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2aagcttctgg gccagttcct<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。
<400>3caaaatgaaa gagctcagcc ccagatg
权利要求
1.一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测样品中SARS病毒存在的方法，该方法包括(1)提供包括样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增系统包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光监测系统包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸探针；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aag ctt ctgggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探针是5’-caa aat gaaaga gct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b)2’-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的荧光检测体系包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
4.根据权利要求1的方法，所说的方法进一步包括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶多核苷酸的量。
5.根据权利要求1的方法，其中所说的SARS病毒选自SARS病毒的任何一种已知的变异体。
6.根据权利要求1的方法，其中所说的靶多核苷酸来自SARS病毒。
7.使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中SARS病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有浓缩液、RNA提取液A、RNA提取液B、逆转录酶反应体系、经焦炭酸乙二脂处理的纯水、PCR扩增反应液I、PCR扩增反应液II、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和RNA阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
8.根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和反向引物分别是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’和5’-aag ctt ctg ggc cag ttc ct-3’。
9.根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3’。
全文摘要
本发明涉及检测临床样品中严重急性呼吸综合症的病原体——SARS病毒存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术早期诊断SARS病毒感染的方法及所使用的试剂盒。
文档编号G01N33/68GK1598580SQ0314684
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者程钢, 何蕴韶, 周新宇 申请人:中山大学达安基因股份有限公司