专利名称：用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，是一种用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法。
背景技术：
大肠杆菌是人畜粪便中数量最多的一种细菌，在卫生学上常被用作饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标。大肠杆菌越多，表明水源受到人畜粪便污染的污染程度越高，病原菌存在的可能性也相对增高，这给人体健康带来潜在的危险性，尤其是肠出血性大肠杆菌会引起人类出血性肠炎甚至死亡，近年来相继在美国、日本、英国、德国等国家流行和暴发。
近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
对细菌总数的常规检测方法，主要有国标法中的通过将样品在培养皿中培养24-48小时后用平板计数法进行细菌菌落计数，这些检测需要在实验室进行多项繁杂分析试验和制备培养基，由于需要培养，所需时间长，还得需要专用设备来进行计数，并且由于没有特异性，不能区别形态相近的致病菌，灵敏度差，需要专业的技术人员来完成，难以实现现场快速检测。目前国内外均在研究开发一些更加快速和灵敏的检测方法，主要工作集中在分子生物学和免疫分析方法上，其中包括一些自动仪器和免疫试剂盒，以及核酸扩增技术。但大多技术仍处于实验室研究阶段，达不到对大
4肠杆菌快速检测的实际需求。
荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种，近些年发展十分 迅速，其灵敏度要高于胶体金免疫技术，在生物医学领域得到日益广泛的 应用。但是常用的荧光染料由于激发光波长范围窄，发射光波长范围宽， 激发光峰值与发射光峰值比较接近，荧光的背景噪声大，而且其荧光瘁灭 速度快，也影响了其广泛应用。
荧光量子点是半径小于或接近玻尔半径的半导体纳米晶粒，因其特 有的量子尺寸效应和表面效应，使其具有激发谱连续分布，发射荧光覆盖 可见光区的性质，激发光峰值与发射光峰值距离远，荧光信号的背景噪声 小，而且其荧光漂白速率慢。根据原料不同和粒径大小的不同，可控制产 生不同颜色和不同波长的发射光，是一类新型的荧光标记物。
发明内容
本发明的目的是公开一种用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记
方法，该方法克服了现有检测大肠杆菌技术的不足和缺陷，具有检测灵敏
度高、检测速度快等优点。
为达到上述目的，本发明的技术解决方案是
一种用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法，其包括步骤
a) 用荧光量子点标记大肠杆菌
将荧光量子点与大肠杆菌抗体耦联作为探针，然后以此耦联有荧光量 子点的抗体与待测样本中的病原菌一一大肠杆菌结合；
b) 用激发光照射待测样本，使标记在大肠杆菌表面的荧光量子点发 射荧光；
c) 利用光敏元件检测荧光信号；
d) 通过图像识别技术以计数方式获得大肠杆菌的数量，或先测出总的荧光强度，通过光强与大肠杆菌数量的线性关系来进行大肠杆菌的计 数，实现对待测样本中大肠杆菌的快速定量检测。
所述的荧光量子点标记方法，其所述a)步骤用荧光量子点标记大肠
杆菌
或将荧光量子点与第二抗体耦联作为探针，大肠杆菌抗体与待测样本 中的大肠杆菌结合，然后以此耦联有荧光量子点的第二抗体与大肠杆菌抗 体结合。
所述的荧光量子点标记方法，其所述a)步骤用荧光量子点标记大肠
杆菌
或将荧光量子点与亲合素耦联作为探针，生物素与第二抗体耦联，大 肠杆菌抗体与待测样本中的大肠杆菌结合，生物素化的第二抗体与大肠杆 菌抗体结合，然后以耦联有荧光量子点的亲合素与第二抗体上的生物素结 合，实现荧光量子点标记大肠杆菌。
所述的荧光量子点标记方法，其所述荧光量子点与大肠杆菌抗体或第 二抗体或亲合素的耦联，是通过静电作用，疏水作用，化学键，化学连接 剂方法中的任意一种，将目标物连接到荧光量子点表面。
所述的荧光量子点标记方法，其所述第二抗体，是以大肠杆菌抗体作 为抗原免疫动物获得的抗体。
所述的荧光量子点标记方法，其所述生物素化的第二抗体，是通过静 电作用，疏水作用，化学键，化学连接剂方法中的任意一种方法将生物素 与第二抗体连接。
所述的荧光量子点标记方法，其所述激发光，是窄波段的半导体激光 器发射出的激发光，或是利用滤光片过滤或光栅分光汞灯的全波段光源获 得的激发光。
所述的荧光量子点标记方法，其所述光敏元件，是CCD或光电倍增管;
6CCD或光电倍增管的前面有滤光片，过滤掉杂散光，只允许荧光量子 点发射的荧光通过，以增强信噪比。
所述的荧光量子点标记方法，其所述d)步骤实现对待测样本中大肠 杆菌的快速定量检测，是利用CCD拍摄图像，通过图像识别技术以计数方 式获得大肠杆菌的数量；或利用光电倍增管检测出总的荧光光强，通过光 强与大肠杆菌数量的线性关系来进行大肠杆菌的计数。
本发明方法检测灵敏度高、检测速度快，实现了大肠杆菌的快速定量 检测。
图1为本发明用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法示意图， 其中图1 (a)为第一种方法；图1 (b)为第二种方法；图1 (c)为第 三种方法；
图2为本发明用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法中利用 CCD拍摄的标记后大肠杆菌图像。
具体实施例方式
本发明利用荧光量子点激发光峰值与发射光峰值距离远，荧光信号的 背景噪声小，荧光漂白速率慢和免疫技术高特异性和高灵敏度等优点，提
出一种荧光量子点作为探针标记大肠杆菌的方法，通过激发光激发，使标 记在大肠杆菌表面的荧光量子点发射荧光，利用CCD或者光电倍增管检测 荧光信号，实现大肠杆菌的快速定量检测。 参见图1对本发明方法做进一步的说明
利用荧光量子点标记大肠杆菌的方法有三种
1)荧光量子点3与大肠杆菌抗体2耦联作为探针，然后以此耦联有
7荧光量子点的抗体与待测样本中的抗原一一大肠杆菌1结合，实现荧光量 子点标记大肠杆菌。
2) 荧光量子点3与第二抗体4耦联作为探针，大肠杆菌抗体2与待 测样本中的大肠杆菌1结合，然后以此耦联有荧光量子点的第二抗体4与 大肠杆菌抗体2结合，实现荧光量子3点标记大肠杆菌1。
3) 荧光量子点3与亲合素6耦联作为探针，生物素5与第二抗体4 耦联，大肠杆菌抗体2与待测样本中的大肠杆菌1结合，第二抗体4与大 肠杆菌抗体2结合，然后以耦联有荧光量子点3的亲合素6再与第二抗体 4上的生物素5结合，实现荧光量子点标记大肠杆菌。
2、 荧光量子点与目标物之间的耦联是通过静电作用，疏水作用，化 学键，化学连接剂等方法中的任意一种，将目标物连接到荧光量子点表面 的。
3、 本发明中所用的激发光可以是窄波段的半导体激光器发射出的激 发光，也可以是利用滤光片过滤或光栅分光汞灯等全波段光源获得的激发 光。
4、 本发明在利用CCD或者光电倍增管检测荧光信号时，CCD或者光 电倍增管的前面有滤光片，过滤掉杂散光，只允许荧光量子点发射的荧光 通过，以增强信噪比。
5、 本发明检测方式上是利用CCD拍摄图像，通过图像识别技术以计
数方式获得大肠杆菌的数量；或者利用光电倍增管检测出总的荧光光强， 通过光强与大肠杆菌数量的校准方程来进行大肠杆菌的计数。
光强与大肠杆菌数量的校准方程，与所使用的荧光量子点的发光强 度、发光波长等因素有关系，也与所使用的光电探测器有关系，不同的仪 器有不同的校准方程，也就是说校准方程的确立必须具体到仪表的制备。 在本发明方法中，校准方程只是一个一般意义的说法。不管这个校准方程是什么，总的荧光强度与细菌总数是成线性关系的， 实施例
采用本发明的第二种标记方法，用CCD拍摄荧光图像来检测。
1) 取含有大肠杆菌待测样本lOli 1;
2) 向待测样本中加入10ii l浓度为5mg/ml的大肠杆菌抗体溶 液，37X:下孵育15分钟；
3) 向上述溶液中加入10u 1的1: 500稀释的已经与生物素耦 联的第二抗体溶液，37"C下孵育15分钟；
4) 向上述溶液中加入10 u 1浓度为10nM的已经与亲合素耦联 的荧光量子点溶液，37'C下孵育15分钟；
5) 用紫外光照射样本，用CCD拍摄样本荧光图像，进行分析 处理。如图2为拍摄到的大肠杆菌荧光图像。
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权利要求
1. 一种用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法，其特征在于，包括步骤a)用荧光量子点标记大肠杆菌将荧光量子点与大肠杆菌抗体耦联作为探针，然后以此耦联有荧光量子点的抗体与待测样本中的病原菌——大肠杆菌结合；b)用激发光照射待测样本，使标记在大肠杆菌表面的荧光量子点发射荧光；c)利用光敏元件检测荧光信号；d)通过图像识别技术以计数方式获得大肠杆菌的数量，或先测出总的荧光强度，通过光强与大肠杆菌数量的校准方程来进行大肠杆菌的计数，实现对待测样本中大肠杆菌的快速定量检测。
2. 如权利要求1所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述a)步骤用荧光量子点标记大肠杆菌或将荧光量子点与第二抗体耦联作为探针，大肠杆菌抗体与待测样本中的大肠杆菌结合，然后以此耦联有荧光量子点的第二抗体与大肠杆菌抗体结合。
3. 如权利要求1所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述a)步骤用荧光量子点标记大肠杆菌或将荧光量子点与亲合素耦联作为探针，生物素与第二抗体耦联，大肠杆菌抗体与待测样本中的大肠杆菌结合，生物素化的第二抗体与大肠杆菌抗体结合，然后以耦联有荧光量子点的亲合素与第二抗体上的生物素结合，实现荧光量子点标记大肠杆菌。
4. 如权利要求l、 2或3所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述荧光量子点与大肠杆菌抗体或第二抗体或亲合素的耦联，是通过静电作用，疏水作用，化学键，化学连接剂方法中的任意一种，将目标物连接到荧光量子点表面。
5. 如权利要求2、 3或4所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述第二抗体，是以大肠杆菌抗体作为抗原免疫动物获得的抗体。
6. 如权利要求3所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述生物素化的第二抗体，是通过静电作用，疏水作用，化学键，化学连接剂方法中的任意一种方法将生物素与第二抗体连接。
7. 如权利要求1所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述激发光，是窄波段的半导体激光器发射出的激发光，或是利用滤光片过滤或光栅分光汞灯的全波段光源获得的激发光。
8. 如权利要求l所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述光敏元件，是CCD或光电倍增管；CCD或光电倍增管的前面有滤光片，过滤掉杂散光，只允许荧光量子点发射的荧光通过，以增强信噪比。
9. 如权利要求1或8所述的荧光量子点标记方法，其特征在于，所述d)步骤实现对待测样本中大肠杆菌的快速定量检测，是利用CCD拍摄图像，通过图像识别技术以计数方式获得大肠杆菌的数量；或利用光电倍增管检测出总的荧光光强，通过光强与大肠杆菌数量的线性关系来进行大肠杆菌的计数。
全文摘要
本发明一种用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法，涉及检测技术，包括步骤a)用荧光量子点标记大肠杆菌将荧光量子点与大肠杆菌抗体耦联作为探针，然后以此耦联有荧光量子点的抗体与待测样本中的病原菌——大肠杆菌结合；b)用激发光照射待测样本，使标记在大肠杆菌表面的荧光量子点发射荧光；c)利用光敏元件检测荧光信号；d)通过图像识别技术以计数方式获得大肠杆菌的数量，或先测出总的荧光强度，通过光强与大肠杆菌数量的线性关系来进行大肠杆菌的计数，实现对待测样本中大肠杆菌的快速定量检测。本发明方法具有检测灵敏度高、检测速度快等优点，实现了大肠杆菌的快速定量检测。
文档编号G01N21/64GK101464410SQ200710179868
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者何保山, 剑 刘, 刘春秀, 岳伟伟, 青 田, 罗金平, 蔡新霞 申请人:中国科学院电子学研究所