专利名称：筛选微生物生长中必需代谢物的方法
技术领域：
本发明涉及使用代谢通量分析筛选对于微生物生长必需的代谢物的方法，所述方法包括选择目标微生物，构建所选微生物的代谢网络模型，使构建的代谢网络模型中每种代谢物的消耗反应停止，分析代谢物的代谢通量以筛选对于微生物生长所必需的代谢物，并通过对每种代谢物的利用确定筛选的代谢物，定义为通量和(Φ)。
背景技术：
当免疫系统弱的人们感染病原微生物时，感染(所述的所有感染都不是难以治疗时)将非常难以治疗并可导致死亡。因此，使用病原微生物的基因组信息发现目标的努力以开发更有效地的抗病原体药物已经被积极地展开。但是，常常难以识别用于药物靶标(产品，其可被用作理想的药物靶标[你使用基因产品生产并用作药物来杀死病原体或者用于药物的基因以中断了吗？这是我们之前所写的])的基因可以作为候选来杀死病原微生物，并且在技术上难以确定相关基因的致命性当剔除所有病原微生物的单个基因时。药物靶标最通常可通过细胞成分之间的复杂相互作用来确定，而不是通过单个基因来确定，剔除多个基因显示致命性，甚至当每个基因都不具有致命性时也是如此。
因此，为了开发靶向病原微生物的有效药物，非常重要的是理解细胞机制和微生物细胞成分之间的相互作用。通过遗传信息和功能遗传学的发展构建的代谢物和代谢网络在理解组成细胞成分的基因和蛋白质之间的相互作用和构建代谢网络以开发有效药物方面具有日益增加的重要性。
事实上，当在哺乳动物细胞中没有发现过的新的代谢物在病原微生物中通过遗传信息使用代谢网络信息识别时，能够开发靶向代谢物特征的治疗方法以专门攻击病原细胞而不在人类细胞中引起副作用。如果这种病原体特异性代谢途径被确认为对于病原微生物的生存所必需的，则能够开发药物来抑制相关代谢途径。据认为，一旦开发了针对病原微生物的药物，则可以使用与其类似的化合物很容易得到抑制其他类似病原微生物的药物。随着遗传信息的可利用性的增加，基于代谢网络的分析和预测技术近来已经变得可行。特别是，随着使用优化技术的生物体代谢及其模拟的数学表示的发展，预测在特定基因缺失或添加之后发生的代谢途径反应正在变得可能(Lee等人，Trend.Biotechnol.，23349，2005)。代谢通量分析(MFA)技术显示了细胞的理想代谢通量，并允许模拟和预测细胞的行为，甚至不需要生理参数(Papin，J.等人，Nature ReviewsMolecular Cell Biology，699，2005)。而且，代谢通量分析是通过测定各种代谢反应方程的系数和代谢物的产生和消耗来确定内部代谢通量变化的技术，并且其以准稳态假设为基础。
代谢通量分析被用于在仅仅使用质量平衡方程和细胞组分信息得到细胞可达到的理想代谢通量空间，并通过优化方法以最大化或最小化特定对象函数为目标(例如，通过特定干扰的生物量形成的最大化或者代谢调节的最小化)。另外，代谢通量分析通常可被用于通过菌株改进计算对于所需代谢物的特定基因的致命性，并用于理解菌株代谢途径的特性。而且，应用代谢通量分析技术来预测基因缺失或添加之后发生的代谢通量变化的各种研究已经被报道。
以前，发明人发展了使用代谢物的通量和来改进生物体的in-silico方法，其中特定代谢物与有用物质的产生的关系可被预测，并且具有在产生有用物质方面增加的能力的生物体可通过引入或扩增表达与特定代谢物有关的酶的基因来发展(韩国专利10-655495)。
美国专利公开US2002/0168654A1公开了用于细胞新陈代谢的in-silico方法，其可通过特定限制改善通量平衡分析(FBA)模型。在该专利的说明书中，试图通过影响细胞生长的限制来识别能够支持细胞生长的代谢反应的最小组，但存在的问题是识别合成的致死基因，因为存在太多的突变组合。
因此，在本发明所属的技术领域中，存在开发这样的方法的需要，即可通过使用代谢通量分析技术以全面的观点检查复杂的微生物新陈代谢来精确地预测病原微生物中的靶基因，而不是使用基于利用部分代谢信息的菌株操作并确定特定基因对整个代谢通量的影响。
因此，本发明的发明人已经付出了极大的努力来开发能够有效预测病原微生物的靶基因的方法。结果，本发明的发明人发现，对于微生物生长所必需的目标基因可通过使代谢网络模型中的每种代谢物的消耗反应停止来分析每种代谢产物的代谢通量并筛选与其消耗反应没有停止的代谢物相比显示细胞生长率下降的代谢物的微生物。
发明内容
本发明的主要目的在于提供使用代谢通量分析筛选对于微生物生长必需的代谢物的方法。
本发明的另一目的在于提供筛选对于微生物的生长所必需的基因的方法，所述方法包括从与筛选的代谢物有关的代谢网络中筛选在对于微生物的生长必需的代谢物中涉及的基因。
本发明的还一目的在于提供使用筛选的基因筛选抑制病原微生物生长的物质的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了使用代谢通量分析筛选对于微生物生长必需的代谢物的方法，所述方法包括下列步骤(a)选择目标微生物并构建所选微生物的代谢网络模型；和(b)使所构建的代谢网络模型中每种代谢物的消耗反应停止，分析每种代谢物的代谢通量，并使用下面的方程2选择与正常细胞生长率相比显示细胞生长率下降低于50％的代谢物作为对于微生物的生长所必需的代谢物 [方程2] 其中rwild代表正常细胞的生长率，rloss代表当相关代谢物的消耗反应停止时下降的细胞生长率。
在本发明中，每种代谢物的消耗反应的停止通过将消耗反应的代谢通量值设为零(0)来进行。
本发明提供了使用代谢通量分析筛选对于微生物生长必需的代谢物的方法，所述方法可在步骤(b)之后进一步包括(c)定义在步骤(b)中选择的代谢物的利用作为由下面的方程3表示的通量和(Φ)，然后计算每种代谢物的通量和(Φ)；和(d)然后确定当每种所选代谢物的通量和(Φ)降低时显示细胞生长下降或停止的代谢物，确认对于微生物生长所必需的代谢物作为微生物生长必需的代谢物 [方程3] 其中Φi表示第ith种代谢物的通量和(Φ)，Sij表示在jth反应中第ith种代谢物的化合系数，vj表示在jth反应中的代谢物的通量，Pi表示产生第ith种代谢物的代谢反应的集合，并且Ci表示消耗第ith种代谢物的代谢反应的集合。
在本发明中，必需代谢物选自下组，包括H+，H2O，ATP，磷酸，ADP，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，CO2，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，丙酮酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，L-谷氨酸，辅酶A，铵，AMP，乙酰辅酶A，2-戊二酸，酰基载体蛋白，磷酸烯醇式丙酮酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘油醛3-磷酸，CMP，甘油3-磷酸，GTP，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸，磷酸二羟基丙酮，L-丙氨酸，L-丝氨酸，D-果糖6-磷酸，丙二酰-[酰基-c载体蛋白]，D-葡萄糖1-磷酸，GDP，草酰乙酸，还原型硫氧还蛋白，FAD，D-葡萄糖6-磷酸，氧化型硫氧还蛋白，UMP，CTP，S-腺苷-L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，α-D-核糖5-磷酸，UDP-葡萄糖，5，6，7，8-四氢叶酸，乙酰乙酰-ACP，UDP，UTP，琥珀酰辅酶A，L-苏氨酸，腐胺，氨基乙酸，GMP，亚精氨，IMP，磷脂酰甘油，L-精氨酸，L-赖氨酸，5，10-亚甲基四氢叶酸，分支酸，D-丙氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺，D-葡萄糖胺6-磷酸，烟酸D-核糖核苷酸，dGTP，亚胺基天冬氨酸，D-核酮糖5-磷酸，十四酰-ACP(n-C14:0ACP)，3-甲基-2-乙酰乙酸乙酯，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，dTMP，磷脂酸，L-缬氨酸，重碳酸盐，dCTP，dUMP，L-谷氨酸5-半醛，内消旋-2，6-二氨基庚二酸，CMP-3-脱氧-D-甘露-乙酰乙酸乙酯，十一异戊二烯二磷酸，L-异亮氨酸，磷脂酰乙醇胺，L-亮氨酸，L-组氨酸，十六烯酰-ACP(n-C16:1ACP)，1-吡咯啉-5-羧酸，亚硫酸盐，氨甲酰磷酸，D-赤藓糖4-磷酸，3-磷酸-D-甘油酸，CDP-甘油二脂，黄苷5′-磷酸，dTTP，L-酪氨酸，L-高半胱氨酸，dATP，10-甲酰四氢叶酸，R-3-羟基-十四酰-ACP，十八烯酰-ACP(n-C18:1ACP)，棕榈酰-ACP(n-C16:0ACP)，(S)-二氢乳清酸，十四烯酰-ACP(n-C14:1ACP)，2-乙酰乙酸乙酯，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，L-苯丙氨酸，磷脂酰丝氨酸，UDP-2，3-二(3-羟基十四酰)葡萄糖胺，L-高丝氨酸，十一异戊二烯磷酸，(R)-泛酸，乳清酸，L-天冬氨酸4-半醛，景天庚糖7-磷酸，N2-甲酸-N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-甲基四氢叶酸，硫化氢，7，8-二氢叶酸，dTDP，肝糖，十二酰-ACP(n-C12:0ACP)，4-(1-D-核糖醇氨)-5-氨基尿嘧啶，苯酚，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑，KDO(2)-脂IV(A)，N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-[(5-磷酸-1-脱氧核酮糖-1-基氨基)亚甲基氨基]-1-(5-磷酸核糖)咪唑-4-甲酰胺，磷脂酰甘氨酸磷酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸，N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸，2-脱氢-3-脱氧-D-阿拉伯糖基-葡庚糖酸7-磷酸，O-磷酸-L-丝氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸，(S)-2-[5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺基]琥珀酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-γ-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酸，3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸，2，3-二(3-羟基十四酰)-β-D-葡糖氨基1-磷酸，3-脱氧-D-manno-辛酸8-磷酸，N-((R)-4-磷酸泛酰基)-L-半胱氨酸，大肠杆菌的肽聚糖亚单位，腺苷5′-磷酸硫酸，二氢叶酸，3-脱氢莽草酸脂，1-(5-磷酸核糖)-AMP，4-甲基-2-氧代戊酸，D-甘油-D-manno-庚糖7-磷酸，2，3，4，5-四氢甲基吡啶酸，3-磷酸羟基丙酮酸，D-甘油-D-manno-庚糖1-磷酸，D-赤式-1-(咪唑-4-基)甘油3-磷酸，硫酸，UDP-3-O-(3-羟基十四酰)-N-乙酰葡萄糖胺，2-氨基-4-羟基-6-(D-赤式-1，2，3-三羟基丙基)-7，8-二氢喋啶，UDP-3-O-(3-羟基十四酰)-D-葡糖胺，乳清酸核苷5′-磷酸，UDP-N-乙酰-3-O-(1-羧乙烯)-D-葡糖胺，6-羟基甲基二氢喋呤，O-乙酰-L-丝氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸，心磷脂，(R)-2，3-二羟基-3-甲基丁酸，(S)-2-乙酰乳酸，3′-磷酸腺嘌呤硫酸，1-(5-磷酸核糖)-ATP，2，3，2′3′-四(β-羟基十四酰)-D-葡糖氨基-1，6-β-D-葡糖胺1，4′-二磷酸，莽草酸脂5-磷酸，(R)-泛解酸，2-脱氢泛解酸，CDP-乙醇胺，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-羧酸，5-磷酸-β-D-核糖胺，N-琥珀酰-2-L-氨基-6-氧代庚二酸，D-4′-磷酸泛酸酯，3-脱氧-D-manno-2-辛酸，ADP-L-甘油-D-manno-庚糖，β-丙氨酸，D-丙氨酰-D-丙氨酸，O-琥珀酰-L-高丝氨酸，羟基喹啉，2-(甲酰胺基)-N1-(5-磷酸-D-核糖)乙脒，D-阿拉伯糖基5-磷酸，1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖氨基)亚甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺，脂多糖，6-羟基甲基-二氢喋呤焦磷酸，莽草酸脂，十一异戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，十一异戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-(N-乙酰葡糖胺)-L-丙氨酸-D-谷氨酸-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酸-D-丙氨酸，5-磷酸核糖-5-羧基氨基咪唑，3-羧基-2-羟基-4-甲基戊酸，N-乙酰-D-葡糖胺1-磷酸，L-胱硫醚，(S)-3-甲基-2-戊酸，5-O-(1-羧乙烯)-3-磷酸莽草酸脂，2-氨基-4-羟基-6-(赤式-1，2，3-三羟基丙基)二氢喋啶三磷酸，D-甘油-D-manno-庚糖1，7-二磷酸，3-(咪唑-4-基)-2-丙基磷酸，3，4-二羟基-2-丁酮4-磷酸，具有月桂酸酯的KDO(2)-脂IV(A)，2-异丙基马来酸，KDO-脂IV(A)，ADP-D-甘油-D-manno-庚糖，KDO(2)-脂(A)，N6-(1，2-二羧乙基)-AMP，5-甲酰胺基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，脂A二糖，2，3-二氢吡啶而羧酸，3-脱氢奎尼酸，4-磷酸-L-天冬氨酸，S-腺苷甲硫氨酸胺，3-羧基-4-甲基-2-氧代戊酸，苯丙酮酸，D-葡糖胺1-磷酸，脱磷酸辅酶A，ADP-葡萄糖，4-氨基苯甲酸，L-组氨醇磷酸，LL-2，6-二氨基庚二酸，二氢喋呤单磷酸，泛酰巯基乙酸4′-磷酸，N-氨甲酰基-L-天冬氨酸，(R)-2，3-二羟基-3-甲基戊酸，丙二酰辅酶A，4-氨基-4-脱氧分支酸，D-谷氨酸，3-(4-羟基苯基)丙酮酸，L-组氨醇，去氨基-NAD+，以及(S)-2-乙酰基-2-羟基丁酸。
在本发明中，根据通量和(Φ)的下降的细胞生长下降类型优选选自下组，包括其中细胞生长线性下降的类型；其中细胞生长降低到临界值以下的类型；以及其中细胞生长非线性下降，于是细胞生长在通量和(Φ)达到零(0)之前停止的类型。而且，通量和(Φ)的扰动优选基于细胞生长下降的类型而变化。
在另一方面，本发明提供了筛选对于微生物生长所需的基因的方法，所述方法包括筛选在上面筛选对于微生物生长必需的代谢物中涉及的基因。在本发明中，目标微生物为大肠杆菌或者病原微生物。
在还一方面，本发明提供了产生转化微生物的方法，所述方法包括使用上面筛选的对于大肠杆菌或病原微生物的生长必需的基因转化模型微生物。
在又一方面，本发明提供了根据所述方法产生的转化微生物，所述微生物使用对于大肠杆菌或病原微生物的生长必需的基因转化。
在再一方面，本发明提供了筛选可以抑制病原微生物的生长的物质的方法，所述方法包括下列步骤(a)在病原微生物的候选抑制剂存在的情况下培养所述转化的微生物；和(b)选择在较之于生长抑制剂不存在情况下的显示出对转化微生物抑制作用的候选物作为病原体生长抑制物。
通过下列具体实施方式
和所附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是显而易见的。
图1是确定必需代谢物的示意图，其中，如果当消耗相应代谢物的代谢反应停止时细胞生长的下降率(f)小于0.5，则相应代谢物被归类为必需代谢物，如果下降率大于0.5，则相应代谢物归类为非必需代谢物。
图2显示了根据通量和(Φ)扰动的细胞生长率变化的预测结果，在图2中， A其中当通量和(Φ)下降时细胞生长线性下降的类型；B其中当通量和(Φ)下降时细胞生长降低到临界值以下的类型；以及C其中当通量和(Φ)下降时细胞生长非线性下降，即细胞生长在通量和(Φ)达到零(0)之前停止的类型。
图3显示了必需代谢物和非必需代谢物已经从细胞中去除的细胞的生长率。在图3中，y-轴基因缺失后细胞生长对正常细胞生长率的比值；x-轴缺失的基因(PpurN，LlpdA，GglyA，PLpurN/lpdA，PLGpurN/lpdA/glyA，和DXdxs/xylB)。
具体实施例方式 在本文中使用的术语“扰动”指的是通过特定外部因素的应用干扰所有代谢物的组以便发现具有所需性质的代谢物的操作。
在本文中使用的术语基因的“缺失”包括使特定基因在生物体中不起作用的所有操作，诸如去除或改变该基因的所有或部分碱基序列。
在本文中使用的术语“培养”被定义为不仅包括微生物诸如细菌、酵母、真菌和动植物细胞的培养，而且包括植物和动物饲养的培养。
在本文中使用的术语“目标微生物”指的是用于筛选对于其生长必须的代谢物的微生物。
在本文中使用的术语“代谢网络模型”指的是含有代谢途径的模型，包括在目标微生物中发生的所有生物化学反应。
在本文中使用的术语“代谢物消耗反应”指的是沿着其中在代谢网络中存在的代谢物被消耗的方向发生的反应。
1.代谢网络构建 在本发明中，使用大肠杆菌作为抑制细胞生长的模型菌株构建新的代谢网络。该系统包括绝大多数大肠杆菌的代谢网络。
2.必需代谢物的定义和必需代谢物的筛选 (1)必需代谢物的定义 为了利用数学方法表示所构建的代谢网络，代谢通量向量(vj，jth代谢反应的代谢通量)可使用所有代谢物、它们的代谢途径和相应的化学模型(Sij；在jth反应中的ith代谢物随时间的理想化合系数)来计算。也就是说，代谢物浓度X随时间的变化可被表示为所有代谢反应的通量和。
而且，如果X随时间的变化为常数，即在准稳态下，代谢物浓度X随时间的变化可被定义为如下方程1 [方程1] S·v＝dX/dt＝0 其中S·v是X随时间的变化，X是代谢物浓度，t为时间。
另外，通过代谢通量分析，每种代谢物的重要性可通过当细胞不通过新陈代谢反应消耗该代谢物时代谢物对细胞生长的影响来确定。在代谢通量分析过程中代谢物的重要性通过计算细胞在其中消耗各种代谢物的所有代谢反应被停止的状态下细胞的生长率与正常细胞生长率的比值来确定。
[方程2] 其中rwild表示正常细胞的生长率，并且rloss表示当相关代谢物的消耗反应停止时细胞生长率的下降。
2-2必需代谢物的筛选 产生给定代谢物而不消耗代谢物的代谢反应在用于确定代谢物重要性的分析过程中不被停止的原因在于，即便代谢物不是必需的，产生代谢物的代谢反应还可产生其他必需代谢物，因此，如果细胞生长由于所述代谢反应而被抑制，则最初的非必需代谢物可被错误地理解为必需的。考虑到这种事实，当计算的细胞生长率不能达到正常细胞生长率的一半时，相应的代谢物被确定为必需的，当计算的细胞生长率超过一半时，相应的代谢物被确定为非必需的(图1)。图1是确定必需代谢物的示意性图示，其中，如果当消耗相应代谢物的代谢反应停止时细胞生长率的下降的比例小于0.5，则相应代谢物被归类为必需代谢物，如果比例大于0.5，则相应代谢物被归类为非必需代谢物。
3.通量和和扰动的定义 在本发明中，每种代谢物每小时产生或消耗的总量或通量和(Φ)由方程3定义，并且当通量和偏离正常水平时，相应代谢物对细胞生长的影响系统地被分析。
[方程3] 其中Φi表示ith代谢物的通量和(Φ)，Sij在jth反应中的ith代谢物随时间的化合系数，vj表示jth代谢反应的代谢通量，Pi表示产生ith代谢物的代谢反应组，并且Ci表示消耗ith代谢物的代谢反应。
通量和(Φ)是新定义的量以表达代谢物的利用，其在现有的代谢分析方法中未被采用过。相关代谢物的利用越多，Φ值变得越高，并且相关代谢物的利用越少，Φ值变得越低。
可以看到，当代谢网络被扰动时，如果细胞的生长率相对于正常水平没有显著变化，则必需代谢物的通量和(Φ)也不显著偏离正常水平，这与非必需代谢物的情况不同。这意味着细胞的生长率可通过将对于细胞生长所必需的代谢物的产生和消耗保持在恒定水平来稳定。如果必需代谢物的通量和(Φ)与正常水平相比降低，则可导致细胞生长的下降。例如，如果必需代谢物的通量和(Φ)下降到正常水平的一半，则在大多数情况下(大约85％)细胞的生长率将下降到一半或更少，如果必需代谢物的通量和(Φ)下降到接近零的值，则可预测细胞生长停止。
在现有的代谢通量分析中，通过特定基因缺失得到的细胞生长率一般通过使相应反应停止的方法来确定。但是，这种方法具有的缺点在于，为了检查通过两个以上的基因缺失造成的细胞生长的降低，与两种以上基因的结合相关的情况必需都被计算。相反，在其中每种代谢物的特征通过定义每种代谢物的重要性并定义其利用来检查的情况下，存在的优点是由两个以上基因的缺失导致的细胞生长的下降可以很容易被分析。
实施例 此后，将进一步参照实施例对本发明进一步进行详细描述。但是本领域技术人可以理解，这些实施例仅仅出于解释的目的，本发明的范围并不限于此。
特别是，下面的实施例仅仅使用大肠杆菌作为模型系统解释了筛选对于微生物生长必需的代谢物的方法，但对本领域技术人员来说显而易见的是，通过本说明书公开的内容，除大肠杆菌以外，其他细菌、酵母。真菌、动物和植物也可被用作模型系统。
实施例1模型系统的构建 作为用于筛选对于微生物的生长必需的代谢物的目标菌株，大肠杆菌突变菌株被用于构建新的代谢通量分析系统。该系统包括大多数大肠杆菌的代谢网络。对于大肠杆菌来说，新的代谢网络由979种生物化学反应和814种代谢物组成(Lee等人，Biotechnol.Bioproc.Eng.，10425-431，2005)。
实施例2必需代谢物的筛选 在实施例1中构建的代谢通量系统中，进行了对于大肠杆菌的814种代谢物的代谢通量分析。在代谢通量分析过程中，代谢物的重要性根据方程2通过计算在其中所有消耗相应代谢物的代谢反应被停止的状态下，即在其中相关消耗反应的代谢通量被设定为零(0)的状态下的细胞生长率与正常细胞生长率的比值来确定。
[方程2] 其中rwild代表正常细胞的生长率，rloss代表当相关代谢物的消耗反应停止时下降的细胞生长率。
当消耗代谢物的代谢反应被停止时检查细胞生长率的下降，如果比值小于0.5，则相应代谢物被归类为必需代谢物。而且，大肠杆菌的下列814种代谢物的重要性在下表1中描述的19种细胞生长条件下被检查H+，H2O，ATP，磷酸，ADP，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，CO2，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，丙酮酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，L-谷氨酸，辅酶A，铵，AMP，乙酰辅酶A，2-戊二酸，酰基载体蛋白，磷酸烯醇式丙酮酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘油醛3-磷酸，CMP，甘油3-磷酸，GTP，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸，磷酸二羟基丙酮，L-丙氨酸，L-丝氨酸，D-果糖6-磷酸，丙二酰-[酰基-c载体蛋白]，D-葡萄糖1-磷酸，GDP，草酰乙酸，还原型硫氧还蛋白，FAD，D-葡萄糖6-磷酸，氧化型硫氧还蛋白，UMP，CTP，S-腺苷-L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，α-D-核糖5-磷酸，UDP-葡萄糖，5，6，7，8-四氢叶酸，乙酰乙酰-ACP，UDP，UTP，琥珀酰辅酶A，L-苏氨酸，腐胺，氨基乙酸，GMP，亚精氨，IMP，磷脂酰甘油，L-精氨酸，L-赖氨酸，5，10-亚甲基四氢叶酸，分支酸，D-丙氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺，D-葡萄糖胺6-磷酸，烟酸D-核糖核苷酸，dGTP，亚胺基天冬氨酸，D-核酮糖5-磷酸，十四酰-ACP(n-C14:0ACP)，3-甲基-2-乙酰乙酸乙酯，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，dTMP，磷脂酸，L-缬氨酸，重碳酸盐，dCTP，dUMP，L-谷氨酸5-半醛，内消旋-2，6-二氨基庚二酸，CMP-3-脱氧-D-甘露-乙酰乙酸乙酯，十一异戊二烯二磷酸，L-异亮氨酸，磷脂酰乙醇胺，L-亮氨酸，L-组氨酸，十六烯酰-ACP(n-C16:1ACP)，1-吡咯啉-5-羧酸，亚硫酸盐，氨甲酰磷酸，D-赤藓糖4-磷酸，3-磷酸-D-甘油酸，CDP-甘油二脂，黄苷5′-磷酸，dTTP，L-酪氨酸，L-高半胱氨酸，dATP，10-甲酰四氢叶酸，R-3-羟基-十四酰-ACP，十八烯酰-ACP(n-C18:1ACP)，棕榈酰-ACP(n-C16:0ACP)，(S)-二氢乳清酸，十四烯酰-ACP(n-C14:1ACP)，2-乙酰乙酸乙酯，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，L-苯丙氨酸，磷脂酰丝氨酸，UDP-2，3-二(3-羟基十四酰)葡萄糖胺，L-高丝氨酸，十一异戊二烯磷酸，(R)-泛酸，乳清酸，L-天冬氨酸4-半醛，景天庚糖7-磷酸，N2-甲酸-N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-甲基四氢叶酸，硫化氢，7，8-二氢叶酸，dTDP，肝糖，十二酰-ACP(n-C12:0ACP)，4-(1-D-核糖醇氨)-5-氨基尿嘧啶，苯酚，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑，KDO(2)-脂IV(A)，N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-[(5-磷酸-1-脱氧核酮糖-1-基氨基)亚甲基氨基]-1-(5-磷酸核糖)咪唑-4-甲酰胺，磷脂酰甘氨酸磷酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸，N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸，2-脱氢-3-脱氧-D-阿拉伯糖基-葡庚糖酸7-磷酸，O-磷酸-L-丝氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸，(S)-2-[5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺基]琥珀酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-γ-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酸，3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸，2，3-二(3-羟基十四酰)-β-D-葡糖氨基1-磷酸，3-脱氧-D-manno-辛酸8-磷酸，N-((R)-4-磷酸泛酰基)-L-半胱氨酸，大肠杆菌的肽聚糖亚单位，腺苷5′-磷酸硫酸，二氢叶酸，3-脱氢莽草酸脂，1-(5-磷酸核糖)-AMP，4-甲基-2-氧代戊酸，D-甘油-D-manno-庚糖7-磷酸，2，3，4，5-四氢甲基吡啶酸，3-磷酸羟基丙酮酸，D-甘油-D-manno-庚糖1-磷酸，D-赤式-1-(咪唑-4-基)甘油3-磷酸，硫酸，UDP-3-O-(3-羟基十四酰)-N-乙酰葡萄糖胺，2-氨基-4-羟基-6-(D-赤式-1，2，3-三羟基丙基)-7，8-二氢喋啶，UDP-3-O-(3-羟基十四酰)-D-葡糖胺，乳清酸核苷5′-磷酸，UDP-N-乙酰-3-O-(1-羧乙烯)-D-葡糖胺，6-羟基甲基二氢喋呤，O-乙酰-L-丝氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸，心磷脂，(R)-2，3-二羟基-3-甲基丁酸，(S)-2-乙酰乳酸，3′-磷酸腺嘌呤硫酸，1-(5-磷酸核糖)-ATP，2，3，2′3′-四(β-羟基十四酰)-D-葡糖氨基-1，6-β-D-葡糖胺1，4′-二磷酸，莽草酸脂5-磷酸，(R)-泛解酸，2-脱氢泛解酸，CDP-乙醇胺，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-羧酸，5-磷酸-β-D-核糖胺，N-琥珀酰-2-L-氨基-6-氧代庚二酸，D-4′-磷酸泛酸酯，3-脱氧-D-manno-2-辛酸，ADP-L-甘油-D-manno-庚糖，β-丙氨酸，D-丙氨酰-D-丙氨酸，O-琥珀酰-L-高丝氨酸，羟基喹啉，2-(甲酰胺基)-N1-(5-磷酸-D-核糖)乙脒，D-阿拉伯糖基5-磷酸，1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖氨基)亚甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺，脂多糖，6-羟基甲基-二氢喋呤焦磷酸，莽草酸脂，十一异戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，十一异戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-(N-乙酰葡糖胺)-L-丙氨酸-D-谷氨酸-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酸-D-丙氨酸，5-磷酸核糖-5-羧基氨基咪唑，3-羧基-2-羟基-4-甲基戊酸，N-乙酰-D-葡糖胺1-磷酸，L-胱硫醚，(S)-3-甲基-2-戊酸，5-O-(1-羧乙烯)-3-磷酸莽草酸脂，2-氨基-4-羟基-6-(赤式-1，2，3-三羟基丙基)二氢喋啶三磷酸，D-甘油-D-manno-庚糖1，7-二磷酸，3-(咪唑-4-基)-2-丙基磷酸，3，4-二羟基-2-丁酮4-磷酸，具有月桂酸酯的KDO(2)-脂IV(A)，2-异丙基马来酸，KDO-脂IV(A)，ADP-D-甘油-D-manno-庚糖，KDO(2)-脂(A)，N6-(1，2-二羧乙基)-AMP，5-甲酰胺基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，脂A二糖，2，3-二氢吡啶而羧酸，3-脱氢奎尼酸，4-磷酸-L-天冬氨酸，S-腺苷甲硫氨酸胺，3-羧基-4-甲基-2-氧代戊酸，苯丙酮酸，D-葡糖胺1-磷酸，脱磷酸辅酶A，ADP-葡萄糖，4-氨基苯甲酸，L-组氨醇磷酸，LL-2，6-二氨基庚二酸，二氢喋呤单磷酸，泛酰巯基乙酸4′-磷酸，N-氨甲酰基-L-天冬氨酸，(R)-2，3-二羟基-3-甲基戊酸，丙二酰辅酶A，4-氨基-4-脱氧分支酸，D-谷氨酸，3-(4-羟基苯基)丙酮酸，L-组氨醇，去氨基-NAD+，以及(S)-2-乙酰基-2-羟基丁酸。
表1 结果，可以观察到所有必需代谢物的大约87.7％在19种生长条件下通常是必需的。相反，必需代谢物的12.2％是必需或非必需的，这取决于19种细胞生长条件。另外，可以确定与其他代谢物相比没有被广泛研究的十六烯酰-ACP(hexadecenoyl-ACP)、磷脂酸甘油和2-异丙基马来酸对于细胞生长都是必需的。
实施例3通过通量和的减少筛选必需代谢物 在实施例2中筛选的必需代谢物的通量和被计算，因此代谢物被确定为对于微生物生长来说是必需的。也就是说，在实施例2中筛选的231种代谢物每小时产生或消耗的总量(通量和；Φ)通量和(Φ)被定义为如方程3所示，当通量和偏离正常水平时，其对细胞生长的影响系统地被分析。
[方程3] 其中Φi表示第ith种代谢物的通量和(Φ)，Sij表示在jth反应中第ith种代谢物的理想化合系数，vj表示jth代谢反应的代谢通量，Pi表示产生第ith种代谢物的代谢反应的集合，并且Ci表示消耗第ith种代谢物的代谢反应。
通量和(Φ)是新定义的量以表达对代谢物的利用，其在现有的代谢分析方法中未被采用过。相关代谢物的利用越多，Φ值变得越高，并且相关代谢物的利用越少，Φ值变得越低。
可以看到，当代谢网络被扰动时，如果细胞的生长率相对于正常水平没有显著变化，则必需代谢物的通量和(Φ)也不显著偏离正常水平，这与非必需代谢物的情况不同。也就是说，这被认为细胞的生长率可通过将对于细胞生长所必需的代谢物的产生和消耗保持在恒定水平来稳定。
如果必需代谢物的通量和(Φ)与正常水平相比降低，则可导致细胞生长的极大下降。例如，如果必需代谢物的通量和(Φ)下降到正常值的一半，则在大多数情况下(大约85％)细胞的生长率将下降到一半或更少。这与非必需代谢物的情况形成显著对照，仅仅少数非必需代谢物显示这种影响(大约28.9％)。也就是说，如果必需代谢物的通量和(Φ)下降到接近零的值，则可预测细胞生长停止的效果。这种变化可被归类为如图2中所示的类型。
在图2中，A组是其中细胞生长随着通量和(Φ)下降而线性下降的情况；B组是其中细胞生长随着通量和(Φ)下降而降低到临界值以下情况；C组是其中细胞生长随着通量和(Φ)下降而非线性下降，于是细胞生长在通量和(Φ)达到零(0)之前停止的情况。
A到C组的生长显示了基于甚至对于相同代谢物的生长条件而变化的趋势，结果在表2中显示。表2显示了在表1中显示的条件中的通量和(Φ)的降低导致大肠杆菌生长的抑制。如表2中所示，可以看出，为了实质上抑制细胞的生长，通量和(Φ)的扰动必须基于每种生长条件下每组的特性而被改变。
表2
在现有代谢通量分析中，由特定基因的缺失得到的细胞生长率通常通过使相应反应停止的方法确定。但是，该方法具有的缺点在于，为了检查通过两个以上的基因缺失造成的细胞生长的降低，与两种以上基因的结合相关的情况必需都被计算。相反，在其中每种代谢物的特征可通过定义每种代谢物的重要性并定义其利用来检查的情况下，存在的优点是由两个以上基因的缺失导致的细胞生长的下降可以很容易被分析。
因此，本发明提供了被施加到每种代谢物上的扰动量可通过将通量和(Φ)定义为代谢物的利用并定量评估通量和降低对细胞生长的影响而系统性地确定的基础。
实施例4细胞生长抑制以及与相应代谢物相关的基因缺失的实验分析 当必需代谢物的通量和(Φ)降低到零(0)时，也就是说，当代谢物没有被产生或消耗时，对细胞生长的影响通过实验来验证。特别是，当在必需代谢物的产生或消耗中涉及的一些基因从细胞中被除去时，检查细胞生长率是否变化。当基因中的每一种缺失时，细胞可继续生长，当所述基因同时被缺失时，产生或消耗相应代谢物的途径被阻断，可使细胞生长停止。必需且同时被归类为当通量和(Φ)降低到零(0)时影响细胞生长的四氢叶酸代谢物在实验中被使用。据预测，如果在与这些代谢物有关的8种代谢反应中的3种代谢反应中涉及的基因(purN，lpdAand glyA)同时被缺失，则必需的四氢叶酸代谢物的消耗将被阻断，从而使细胞停止生长。
为了在上述结果的基础上构建大肠杆菌突变菌株，使用DNA操纵标准方案(Sambrook等人，Molecular Cloninga Laboratory Manual，3rdedition，2001)，并且使用目标基因通过使用表3的引物序列同源重组经一步失活法取代大肠杆菌K-12 W3110中的抗生素抗性基因(Warner等人，PNAS，97(12)6640-6645，2000)，从而去除对抗生素的抗性。在表3中，Cmr表示氯霉素抗性，Kmr表示卡那霉素抗性。
表3
通过上述结果可以观察到，当每种基因被独立缺失或者当两种基因(purN和lpdA)同时被缺失时，细胞继续生长，但当所有三种基因同时被缺失时，则细胞的生长停止(见表4和图3)。
表4 相反，在理论上被归类为非必需的代谢物1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的情况下，观察到即便当产生代谢物的基因(dxs和xylB)被缺失，细胞与正常状态也没有很大的不同(图3)。在图3中，P表示purN基因；L，lpdA基因；G，glyA基因；PL，purN/lpdA基因；PLG，purN/lpdA/glyA基因；以及DX，dxs/xylB基因。这些实验结果证明，必需代谢物的通量和(Φ)的下降可对细胞生长具有显著影响，但非必需代谢物的通量和(Φ)下降对于细胞生长没有任何特别的影响。
工业实用性 如上所述，根据本发明，对于微生物生长必需的代谢物和在必需代谢物中涉及的基因可以方便的方式被筛选出来，由必需代谢物的代谢利用(通量和，Φ)的下降导致的细胞生长率可被预测。因此，根据本发明，针对病原微生物的药物目标基因可通过与筛选的代谢物有关的基因缺失来预测。
虽然已经参照具体特征对本发明进行了详细描述，但本领域技术人员将会理解，该描述仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。
序列表
<110>韩国科学技术院
<120>筛选微生物生长中必需代谢物的方法
<130>FP09KR848
<140>PCT/KR2007/006708
<141>2007-12-21
<150>10-2006-0133119
<151>2006-12-22
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>72
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOpurNup primer
<400>1
atgaatattg tggtgcttat ttccggcaac ggaagtaatt tacaggcaat gattgcagca60
ttacacgtct tg72
<210>2
<211>71
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOpurNdo primer
<400>2
tttcgtgcat tttcagacga ccatcggcaa accagctaat caccagtgga cacttaacgg60
ctgacatggg a 71
<210>3
<211>77
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>UPKOlpd1 primer
<400>3
agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa accgatatcg acaaggattg60
cagcattaca cgtcttg 77
<210>4
<211>71
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>DOKOlpd1 primer
<400>4
tcaacgcgga tgaaaccacg gtcgtcaact tccacgcctg ctttgcctgc cacttaacgg60
ctgacatggg a 71
<210>5
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>UPKOlpd2 primer
<400>5
atcccttcta aagcactgct gcacgtagca aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct60
gaacacggta 70
<210>6
<211>75
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>DOKOlpd2 primer
<400>6
accgacgata tcgccgatag caaagatgtg cggtacgttg gtacgcagct gtttgtcaac60
gcggatgaaa ccacg 75
<210>7
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOdlyAup primer
<400>7
caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaga ttgcagcatt60
acacgtcttg 70
<210>8
<211>69
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOglyAdo primer
<400>8
ctcgataacg gcttcatcat tgatgctgtc cagcacgtca cacatccaca cttaacggct60
gacatggga69
权利要求
1、一种使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，所述方法包括下列步骤
(a)选择目标微生物并构建所选微生物的代谢网络模型；和
(b)使所构建的代谢网络模型中每种代谢物的消耗反应停止，分析每种代谢物的代谢通量，并使用下面的方程2选择与正常细胞生长率相比显示细胞生长率下降低于50％的代谢物作为对于微生物的生长必需的代谢物
[方程2]
其中rwild代表正常细胞的生长率，rloss代表当相关代谢物的消耗反应停止时下降的细胞生长率。
2、根据权利要求1所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，每种代谢物的消耗反应的停止通过将消耗反应的代谢通量值设为零(0)来进行。
3、根据权利要求1所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，所述方法可在步骤(b)之后进一步包括
(c)定义在步骤(b)中选择的代谢物的利用作为由下面的方程3表示的通量和(Φ)，然后计算每种代谢物的通量和(Φ)；
[方程3]
其中Φi表示第ith种代谢物的通量和(Φ)，Sij表示在jth反应中第ith种代谢物的化合系数，vj表示在jth反应中的代谢物的通量，Pi示产生第ith种代谢物的代谢反应的集合，并且Ci表示消耗第ith种代谢物的代谢反应的集合；以及
(d)然后确定当每种所选代谢物的通量和(Φ)降低时显示细胞生长下降或停止的代谢物，确认对于微生物生长所必需的代谢物作为微生物生长必需的代谢物
4、根据权利要求1-3任意之一所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，必需代谢物选自下组，包括H+，H2O，ATP，磷酸，ADP，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，CO2，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，丙酮酸，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，L-谷氨酸，辅酶A，铵，AMP，乙酰辅酶A，2-戊二酸，酰基载体蛋白，磷酸烯醇式丙酮酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘油醛3-磷酸，CMP，甘油3-磷酸，GTP，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸，磷酸二羟基丙酮，L-丙氨酸，L-丝氨酸，D-果糖6-磷酸，丙二酰-[酰基-c载体蛋白]，D-葡萄糖1-磷酸，GDP，草酰乙酸，还原型硫氧还蛋白，FAD，D-葡萄糖6-磷酸，氧化型硫氧还蛋白，UMP，CTP，S-腺苷-L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，α-D-核糖5-磷酸，UDP-葡萄糖，5，6，7，8-四氢叶酸，乙酰乙酰-ACP，UDP，UTP，琥珀酰辅酶A，L-苏氨酸，腐胺，氨基乙酸，GMP，亚精氨，IMP，磷脂酰甘油，L-精氨酸，L-赖氨酸，5，10-亚甲基四氢叶酸，分支酸，D-丙氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺，D-葡萄糖胺6-磷酸，烟酸D-核糖核苷酸，dGTP，亚胺基天冬氨酸，D-核酮糖5-磷酸，十四酰-ACP(n-C14:0ACP)，3-甲基-2-乙酰乙酸乙酯，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，dTMP，磷脂酸，L-缬氨酸，重碳酸盐，dCTP，dUMP，L-谷氨酸5-半醛，内消旋-2，6-二氨基庚二酸，CMP-3-脱氧-D-甘露-乙酰乙酸乙酯，十一异戊二烯二磷酸，L-异亮氨酸，磷脂酰乙醇胺，L-亮氨酸，L-组氨酸，十六烯酰-ACP(n-C16:1ACP)，1-吡咯啉-5-羧酸，亚硫酸盐，氨甲酰磷酸，D-赤藓糖4-磷酸，3-磷酸-D-甘油酸，CDP-甘油二脂，黄苷5′-磷酸，dTTP，L-酪氨酸，L-高半胱氨酸，dATP，10-甲酰四氢叶酸，R-3-羟基-十四酰-ACP，十八烯酰-ACP(n-C18:1ACP)，棕榈酰-ACP(n-C16:0ACP)，(S)-二氢乳清酸，十四烯酰-ACP(n-C14:1ACP)，2-乙酰乙酸乙酯，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，L-苯丙氨酸，磷脂酰丝氨酸，UDP-2，3-二(3-羟基十四酰)葡萄糖胺，L-高丝氨酸，十一异戊二烯磷酸，(R)-泛酸，乳清酸，L-天冬氨酸4-半醛，景天庚糖7-磷酸，N2-甲酸-N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-甲基四氢叶酸，硫化氢，7，8-二氢叶酸，dTDP，肝糖，十二酰-ACP(n-C12:0ACP)，4-(1-D-核糖醇氨)-5-氨基尿嘧啶，苯酚，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑，KDO(2)-脂IV(A)，N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-[(5-磷酸-1-脱氧核酮糖-1-基氨基)亚甲基氨基]-1-(5-磷酸核糖)咪唑-4-甲酰胺，磷脂酰甘氨酸磷酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸，N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸，2-脱氢-3-脱氧-D-阿拉伯糖基-葡庚糖酸7-磷酸，O-磷酸-L-丝氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸，(S)-2-[5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺基]琥珀酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-γ-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酸，3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸，2，3-二(3-羟基十四酰)-β-D-葡糖氨基1-磷酸，3-脱氧-D-manno-辛酸8-磷酸，N-((R)-4-磷酸泛酰基)-L-半胱氨酸，大肠杆菌的肽聚糖亚单位，腺苷5′-磷酸硫酸，二氢叶酸，3-脱氢莽草酸脂，1-(5-磷酸核糖)-AMP，4-甲基-2-氧代戊酸，D-甘油-D-manno-庚糖7-磷酸，2，3，4，5-四氢甲基吡啶酸，3-磷酸羟基丙酮酸，D-甘油-D-manno-庚糖1-磷酸，D-赤式-1-(咪唑-4-基)甘油3-磷酸，硫酸，UDP-3-O-(3-羟基十四酰)-N-乙酰葡萄糖胺，2-氨基-4-羟基-6-(D-赤式-1，2，3-三羟基丙基)-7，8-二氢喋啶，UDP-3-O-(3-羟基十四酰)-D-葡糖胺，乳清酸核苷5′-磷酸，UDP-N-乙酰-3-O-(1-羧乙烯)-D-葡糖胺，6-羟基甲基二氢喋呤，O-乙酰-L-丝氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸，心磷脂，(R)-2，3-二羟基-3-甲基丁酸，(S)-2-乙酰乳酸，3′-磷酸腺嘌呤硫酸，1-(5-磷酸核糖)-ATP，2，3，2′3′-四(β-羟基十四酰)-D-葡糖氨基-1，6-β-D-葡糖胺1，4′-二磷酸，莽草酸脂5-磷酸，(R)-泛解酸，2-脱氢泛解酸，CDP-乙醇胺，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-羧酸，5-磷酸-β-D-核糖胺，N-琥珀酰-2-L-氨基-6-氧代庚二酸，D-4′-磷酸泛酸酯，3-脱氧-D-manno-2-辛酸，ADP-L-甘油-D-manno-庚糖，β-丙氨酸，D-丙氨酰-D-丙氨酸，O-琥珀酰-L-高丝氨酸，羟基喹啉，2-(甲酰胺基)-N1-(5-磷酸-D-核糖)乙脒，D-阿拉伯糖基5-磷酸，1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖氨基)亚甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺，脂多糖，6-羟基甲基-二氢喋呤焦磷酸，莽草酸脂，十一异戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，十一异戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-(N-乙酰葡糖胺)-L-丙氨酸-D-谷氨酸-内消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酸-D-丙氨酸，5-磷酸核糖-5-羧基氨基咪唑，3-羧基-2-羟基-4-甲基戊酸，N-乙酰-D-葡糖胺1-磷酸，L-胱硫醚，(S)-3-甲基-2-戊酸，5-O-(1-羧乙烯)-3-磷酸莽草酸脂，2-氨基-4-羟基-6-(赤式-1，2，3-三羟基丙基)二氢喋啶三磷酸，D-甘油-D-manno-庚糖1，7-二磷酸，3-(咪唑-4-基)-2-丙基磷酸，3，4-二羟基-2-丁酮4-磷酸，具有月桂酸酯的KDO(2)-脂IV(A)，2-异丙基马来酸，KDO-脂IV(A)，ADP-D-甘油-D-manno-庚糖，KDO(2)-脂(A)，N6-(1，2-二羧乙基)-AMP，5-甲酰胺基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，脂A二糖，2，3-二氢吡啶而羧酸，3-脱氢奎尼酸，4-磷酸-L-天冬氨酸，S-腺苷甲硫氨酸胺，3-羧基-4-甲基-2-氧代戊酸，苯丙酮酸，D-葡糖胺1-磷酸，脱磷酸辅酶A，ADP-葡萄糖，4-氨基苯甲酸，L-组氨醇磷酸，LL-2，6-二氨基庚二酸，二氢喋呤单磷酸，泛酰巯基乙酸4′-磷酸，N-氨甲酰基-L-天冬氨酸，(R)-2，3-二羟基-3-甲基戊酸，丙二酰辅酶A，4-氨基-4-脱氧分支酸，D-谷氨酸，3-(4-羟基苯基)丙酮酸，L-组氨醇，去氨基-NAD+，以及(S)-2-乙酰基-2-羟基丁酸。
5、根据权利要求3所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，根据通量和(Φ)的下降的细胞生长下降类型优选选自下组，包括其中细胞生长线性下降的类型；其中细胞生长降低到标准值以下的类型；以及其中细胞生长非线性下降，于是细胞生长在通量和(Φ)达到零(0)之前停止的类型。
6、根据权利要求5所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，通量和(Φ)的扰动基于细胞生长下降的类型而变化。
7、根据权利要求1所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，目标微生物为大肠杆菌。
8、根据权利要求1-3任意之一所述的使用代谢通量分析筛选对微生物生长必需的代谢物的方法，其特征在于，目标微生物为病原微生物。
9、一种筛选对于微生物生长所需的基因的方法，所述方法包括筛选在通过在权利要求1-3中任意之一的权利要求的方法筛选的微生物的生长必需的代谢物中涉及的基因。
10、根据权利要求9的筛选对于微生物生长所需的基因的方法，其特征在于，目标微生物为大肠杆菌。
11、根据权利要求9的筛选对于微生物生长所需的基因的方法，其特征在于，目标微生物为病原微生物。
12、一种产生转化微生物的方法，所述方法包括使用权利要求10的方法筛选的对于大肠杆菌的生长必需的基因转化的模型微生物。
13、一种产生转化微生物的方法，所述方法包括使用权利要求11的方法筛选的对于病原微生物的生长必需的基因转化的模型微生物。
14、一种根据权利要求12所述的方法并使用对于大肠杆菌的生长必需的基因转化的转化微生物。
15、一种根据权利要求13所述的方法并使用对于病原微生物的生长必需的基因转化的转化微生物。
16、一种筛选抑制病原微生物的生长的物质的方法，所述方法包括下列步骤
(a)在病原微生物的候选抑制剂存在的情况下培养所述转化的微生物；和
(b)选择与其中转化微生物在不存在生长抑制剂候选物时培养的情况下相比显示已知转化微生物生长的候选物作为抑制病原微生物生长的物质。
全文摘要
本发明公开了使用代谢通量分析筛选对于微生物生长必需的代谢物的方法。更具体地说，本发明涉及通过选择目标微生物、构建所选微生物的代谢网络模型、使所构建的代谢网络模型中每种代谢物的消耗反应停止、分析每种代谢物的代谢通量，并通过对每种代谢物的利用(定义为通量和(Φ))确定所选的代谢物来筛选对于微生物的生长必需的代谢物的方法。根据本发明，对于微生物生长必需的代谢物和在必需代谢物中涉及的基因可以方便的方式筛选，并且根据本发明，针对病原微生物的药物目标基因可通过缺失与代谢物有关的基因来预测。
文档编号G01N33/48GK101611312SQ200780047644
公开日2009年12月23日 申请日期2007年12月21日 优先权日2006年12月22日
发明者李相烨, 郑夏雄, 金兑勇, 金潘俊, 李光浩 申请人:韩国科学技术院