专利名称：一种痰液的检测、分析方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，涉及一种痰液的检测、分析方法，具体涉及一种检测分析痰液中细胞、细胞因子以及炎症介质变化的方法。本方法有助于呼吸系统疾病支气管哮喘的分型和中医证型的微观辨证。
背景技术：
临床医学研究显示，支气管哮喘是由多种炎症细胞、细胞因子和炎性介质等所促成的慢性气道炎症性疾病，属于中医学哮病的范畴。中医学认为“伏痰”是哮病的宿根。其基本病理变化为伏痰遇感引触，痰随气升，气因痰阻，相互搏结，壅塞气道，而致痰鸣如吼， 气息喘促。与现代医学认为慢性气道炎症是哮喘的重要病理基础一样，中医的痰在哮病的发病当中也占据着枢纽的位置。对于哮病发作期，中医学认为素体阳虚，外感于寒，则发为冷哮；素体阳盛，外感于热，则发为热哮，主要以“寒痰、热痰”等证型进行辨证治疗。一般认为，中医“热痰证”与呼吸道细菌等病原体感染有着密切的关系。有研究发现热哮血中性粒细胞往往明显升高，寒哮嗜酸性粒细胞明显升高，其反映了血中炎症细胞的结果，但未见其对哮喘寒痰证和热痰证气道局部的炎症指标进行分析。鉴于中医“有形之痰”在哮病中的重要性，有关研究领域已在关注哮喘寒痰证和热痰证患者痰和血中炎症细胞的变化的关系。目前国内外尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种痰液的检测、分析方法及其用途，具体涉及一种检测分析痰液中细胞、细胞因子以及炎症介质变化的方法。本发明针对中医哮喘寒痰证和热痰证患者痰和血中炎症细胞的变化的关系，提供一种利用诱导痰技术对痰液进行检测、分析的方法。本方法有助于呼吸系统疾病支气管哮喘的分型和中医证型的微观辨证。具体而言，本方法采用诱导痰技术分析哮喘寒痰证和热痰证患者痰和血中炎症细胞的变化，并结合相关的炎症因子及炎性介质的变化，提供用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标，并评价其可靠性。具体而言，本方法采用诱导痰技术使哮喘寒痰证、热痰证患者咳出深部痰液，对痰液进行细胞学分类计数以及检测痰上清液和血清中IL-8、IL-5、ECP、IL_4、IL_6、IL-10、 IFN-γ, LTB4、CRP等相关炎症指标，提供用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标，并评价其可靠性。本方法采用诱导痰技术使患者咳出深部痰液，分析痰液中炎性细胞、相关细胞因子的方法，并与血液中的相关指标进行比较，包括下述步骤1)诱导痰技术根据Pin等的改良方法，制定下述流程①测基础第一秒用力呼气量(FEV1)；②吸入沙丁胺醇；③IOmin后再测FEV1作为基础值；④室温下超声雾化器吸入消毒的高渗盐水；⑤间隔测FEV1和连续监测脉搏血氧饱和度；⑥测得FEV1降低值大于20%基础值时，暂停雾化吸入试验；⑦收集雾化吸入后第5、 10、15、20min咳出深部的。2)细胞学检测镜下挑选上述痰液黏稠部分，称重后加入0. 二硫苏糖醇 (DTT)，置于37°C水浴箱，螺旋振荡至均勻，离心，制作细胞涂片，染色，光镜下计数400个以上非立方上皮细胞，分类计数，留取上清液，-70°C冰箱冻存。3)根据哮喘发作期的中医辨证分类证型，收集符合寒痰证、热痰证的哮喘患者痰涂片染色，显微镜下进行细胞分类计数，检测痰液和血液嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比；血常规测定嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比；用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测痰上清液和血清白介素-8 (IL-8)、IL-5、嗜酸性阳离子蛋白(ECP)、IL_4、IL_6、IL-10、干扰素-Y (IFN- γ )、白三烯B4 (LTB4)、C反应蛋白(CRP)。4)分析比较痰液中炎性细胞、相关细胞因子与血液中的相关指标，获得用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标。所述的参考指标包括痰上清液和血清中相关炎症指标嗜酸性粒细胞、嗜酸性阳离子蛋白、中性粒细胞、诱导痰EOS和嗜酸性阳离子蛋白、白三烯B4、TH2和/或C反应蛋白。所述的参考指标可用作制定评价支气管哮喘中医“寒痰、热痰证”微观辨证指标。经临床患者检测、分析，结果显示，哮喘寒痰证中嗜酸性粒细胞、ECP明显升高；热痰证中中性粒细胞明显升高。提示，诱导痰EOS和ECP可作为哮喘寒痰证微观辨证的重要指标之一，中性粒细胞作为哮喘热痰证微观辨证的重要指标之一，LTB4作为寒痰证的微观辨证指标的可能性值得进一步研究，哮喘寒痰证可能有TH2优势型的表现，与嗜酸性粒细胞哮喘表现有类似之处，而CRP等则可能成为人类诸多炎症性疾病的微观性指标。本发明所采用诱导痰技术对哮喘“寒痰、热痰”证进行微观辨证的方法具有安全、 可靠、重复性好，可反映哮喘气道局部的炎症特点，该方法可用于慢性支气管哮喘及其他呼吸道疾病致病机制、预防和治疗以及药物筛选等的研究。
具体实施方案实施例1病例收集按照中医辨证分为哮喘寒痰证组、热痰证组、非寒痰热痰证组，另设正常人组。测各组外周血细胞分类计数及相关炎症指标；采用诱导痰技术使患者咳出深部痰液行痰涂片进行细胞分类计数，留取痰上清液检测相关炎症指标。主要试剂及仪器10%的氯化钠(上海旭东海普药业有限公司)；灭菌注射用水 (上海福达制药有限公司)；0.1%二硫苏糖醇(美国calbiochem公司制造，进口分装)； 瑞士染色液(Amresco) ；IL-4试剂盒、INF- γ试剂盒、IL-6试剂盒、IL-8试剂盒、IL-10试剂盒、ECP试剂盒、CRP试剂盒、LTB4试剂盒、IL-5试剂盒(Biosource进口分装)；全自动血分析仪(美国雅培CELL-DYN3500R) ；YS9801型医用超声雾化器(上海亿圣科技有限公司)；低温冰箱(丹麦Heto ultra Freeze)；台式电动离心机(80-1型)(上海医科大学仪器厂)；双目显微镜(olympus)(上海肯强仪器有限公司)；温控水浴摇床(丹麦heto)；肺功能仪(德国耶格公司)；酶标仪multiscanMK3(芬兰Thermo electron corporation)；冷冻管(Cryovial T311-2)(基因有限公司)。
1)诱导痰技术按下述流程①测基础第一秒用力呼气量(FEV1)；②吸入200 μ g沙丁胺醇；③IOmin后再测 FEV1作为基础值；④在室温下超声雾化器吸入已消毒的高渗盐水，浓度固定为5%，雾量调整为^il/min，吸入时间控制在20min内；⑤视患者病情严重程度不同，可以每间隔^iin测 FEV1和连续监测脉搏血氧饱和度；⑥在雾化吸入期间，患者出现不适或测得FEV1降低值大于20%基础值时，立即暂停试验；⑦鼓励患者于雾化吸入开始后第5、10、15、20min用力咳出深部的痰，或欲咳痰时咳痰；咳前双氧水漱口，咳于无菌容器中，收集痰液至少Ig以上。2)细胞学检测在倒置显微镜下挑选出黏稠部分，称重后加入2倍体积的0. 1% 二硫苏糖醇(DTT)，置于37°C水浴箱，螺旋振荡15min至均勻，3500r/min(r = 15cm)离心 20min。制作细胞涂片，瑞士染色，光镜下计数400个以上非立方上皮细胞，进行分类计数。 留取上清液，-70°C冰箱冻存。3)根据哮喘发作期的中医辨证分类证型，收集符合寒痰证、热痰证的哮喘患者痰涂片染色，显微镜下进行细胞分类计数，检测痰液和血液嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比；血常规测定嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比；用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测痰上清液和血清白介素-8 (IL-8)、IL-5、嗜酸性阳离子蛋白(ECP)、IL_4、IL_6、IL-10、干扰素-Y (IFN- γ )、白三烯B4 (LTB4)、C反应蛋白(CRP)。4)分析比较痰液中炎性细胞、相关细胞因子与血液中的相关指标，获得用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标。检测、分析结果显示血EOS在寒痰证组明显高于正常组、热痰证组及非寒痰热痰证组(P < 0. 01)；血 PMN在各组间差别无统计学意义(P >0.05)；寒痰证组痰EOS明显高于正常组、热痰证组与非寒痰热痰证组(P < 0. 01)。痰PMN在热痰证组高于寒痰证组、非寒痰热痰证组及正常人组，有统计学意义(P<0. 05)。表1是各组血、痰中EOS和P丽的比较结果。表 1.
组别η血 EOS(%)血 ΡΜΝ(%)痰 EOS(%)痰 PMN(%)热痰证组322.60 (4.65) ”·58.66 ±9.220.00 (1.00) “65.12±32.4(ΓΔΑ寒痰证组276.70 (5.45) **ΛΔ55.47 + 4.558.50 (38.25) 一1 44.20±30.94非寒痰热痰证组312.60 (4.70)56.65 ±7.150.00 (2.00)44.03 ±32. 67正常人组332.00 (2.10)56.19 + 6.730.00 (0.50)44.03 ±28. 65注与正常人组比较Zp < 0. 05广ρ < 0. 01 ；与非寒痰热痰证组比较，Δρ < 0. 05， ΔΔρ < 0.01，与寒痰证组比较，aP < 0. 05, aaP < 0.01。IL-8、IL-5、IL_4、IFN- y /IL_4在寒痰证组、热痰证组、非寒痰热痰证组和正常人组之间无明显统计学差异(P >0.05)；痰ECP在寒痰证组和非寒痰热痰证组均明显高于正常人组(P <0.05)，组间比较差别无统计学意义(P>0.(^)；痰IL-6在非寒痰热痰证组明显高于正常人组，有统计学意义(P < 0. 01)，组间比较无统计学差异(P > 0. 05)；热痰证组和非寒痰热痰证组IL-10明显高于正常人组(P < 0. 05)，两组间比较，差别无统计学意义 (P > 0. 05) ； IFN- γ在寒痰证组和非寒痰热痰证组高于正常人组(P < 0. 05)，两组间比较， 差别无统计学意义(P > 0. 05)；痰上清液LTB4在寒痰证组明显高于正常组(P < 0. 05)，较其他组也有升高趋势。表2，表3是寒痰证组、热痰证组、非寒痰热痰证组和正常人组痰上清液和血清 IL-8、IL-5、ECP、IL-4、IL-6、IL-10, IFN-γ、LTB4、CRP 的比较结果。表4是血清和痰上清液中各项炎症指标的相关性。表2.各组痰上清液炎症指标的比较M^lR)
权利要求
1.一种痰液的检测、分析方法，其特征在于，采用诱导痰技术获得哮喘患者咳出的深部痰液，对痰液进行细胞学分类计数以及检测痰上清液和血清中相关炎症指标，提供用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标，并评价其可靠性。
2.按权利要求1所述的痰液的检测、分析方法，其特征在于，其包括下述步骤1)诱导痰技术①测基础第一秒用力呼气量FEV1 ；②吸入沙丁胺醇；③IOmin后再测FEV1作为基础值； ④室温下超声雾化器吸入消毒的高渗盐水；⑤间隔测FEV1和连续监测脉搏血氧饱和度；⑥ 测得FEV1降低值大于20%基础值时，暂停雾化吸入试验；⑦收集雾化吸入后第5、10、15、 20min咳出深部的痰液；2)细胞学检测镜下挑选上述痰液黏稠部分，称重后加入0.二硫苏糖醇(DTT)，置 37°C水浴箱，螺旋振荡至均勻，离心，制作细胞涂片，染色，光镜下计数400个以上非立方上皮细胞，分类计数，留取上清液，_70°C冰箱冻存；3)根据哮喘发作期的中医辨证分类证型，收集符合寒痰证、热痰证的哮喘患者痰涂片染色，显微镜下细胞分类计数，检测痰液和血液嗜酸性粒细胞、中性粒细胞百分比；血常规测定嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比；检测痰上清液和血清中相关炎症指标；4)分析比较痰液中炎性细胞、相关细胞因子与血液中的相关炎症指标，获得用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标。
3.按权利要求1或2所述的痰液的检测、分析方法，其特征在于，所述的痰上清液和血清中相关炎症指标为血清白介素_8、IL-5、嗜酸性阳离子蛋白、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素-Y、白三烯B4和C反应蛋白。
4.权利要求1或2所述的方法在制定评价支气管哮喘中医“寒痰、热痰证”微观辨证指标中的用途。
5.按权利要求4的用途，其特征在于，所述的指标是是嗜酸性粒细胞、嗜酸性阳离子蛋白、中性粒细胞、诱导痰EOS和嗜酸性阳离子蛋白、白三烯B4、TH2和/或C反应蛋白。
6.按权利要求4的用途，其特征在于，所述的哮喘寒痰证中嗜酸性粒细胞和嗜酸性阳离子蛋白升高。
7.按权利要求4的用途，其特征在于，所述的热痰证中中性粒细胞升高。
全文摘要
本发明属生物医学领域，涉及一种痰液的检测、分析方法及其用途，本方法采用诱导痰技术使哮喘寒痰证、热痰证患者咳出深部痰液，对痰液进行细胞学分类计数以及检测痰上清液和血清中相关炎症指标，提供用于支气管哮喘中医“寒痰、热痰”微观辨证的参考指标，并评价其可靠性。结果证实，本发明方法具有安全、可靠、重复性好，可反映哮喘气道局部的炎症特点，有助于呼吸系统疾病支气管哮喘的分型和中医证型的微观辨证。该方法可用于慢性支气管哮喘及其他呼吸道疾病致病机制、预防和治疗以及药物筛选等的研究。
文档编号G01N33/50GK102192976SQ20101011894
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者崔焱, 曹玉雪, 杜懿杰, 董竞成 申请人:复旦大学附属华山医院