专利名称：蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途，即三叶因子(trefoil factor,TFFs)及其衍生结构作为蛋白酶激活受体(protease-activated receptors,PARs) 的激动剂在细胞迁移及创伤修复制药中的应用；本发明同时提供三叶因子和蛋白酶激活受 体表达变异在临床胃肠道肿瘤疾病检测中的应用，属生物医学领域。
背景技术：
蛋白酶激活受体(protease-activated receptor, PAR)属于单链七次跨膜的G蛋白偶联受体(GPCR)家族。目前为止，一共有四种PAR亚型被发现，分别是PAR1、PAR2、PAR3 和PAR4，除了 PAR2为胰蛋白酶激活受体外，其他三个都是凝血酶的受体。在不同细胞类群 中，PAR受体的表达存在差异，如人血小板仅表达PARI和PAR4，胃癌细胞株AGS本身不表达 PAR4，而HT-29细胞株则表达PARI、PAR2和PAR4。PAR受体在血液循环系统、呼吸系统、神 经系统和消化系统中都发挥了重要的功能，与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等密切相 关。凝血酶受体I(PARl)参与正常的血小板聚集过程，PARI激动剂可诱导人血小板聚集， 涉及Ca2+动员和促凝活性的增强，可用于止血药物的开发。蛋白酶受体在神经元和星形胶 质细胞的存活中具有重要的作用，特别是涉及到损伤和炎症中神经元的功能。PARI激动剂 可极大地保护星形胶质细胞和海马神经元，避免包括低血糖症和氧化应急环境刺激引起的 死亡。PARI激活可引起身体镇痛，其激动剂可望用于镇痛药物的开发。雾化剂给予PAR4激 动剂可抑制5-羟色胺(5-HT)诱导的支气管痉挛，抑制组氨诱导的气道阻力增加，目前PAR4 激动剂正进行治疗哮喘药物的开发。PARI在损伤修复中起作用，PARI激活剂局部应用到损 伤组织中可促进血管生成，具有促进损伤愈合的功能。总而言之，蛋白酶受体1和4的激动 剂在制药中具有广泛的应用前景。细胞迁移是机体正常生长发育必不可缺的生理过程。组织修复再生、创伤修复的 过程中离不开它。在上皮愈合的过程中，涉及细胞脱落和调亡，基质暴露，细胞和细胞间连 接的解聚，细胞迁移和细胞连接的重构的过程。三叶因子(trefoil factor,TFF)为一类含 有一个或者多个三叶因子结构域的分泌型的蛋白质，三叶因子结构域由大约38 39个氨 基酸残基组成，含有6个半胱氨酸，以1-5，2-4，3-6的形式形成二硫键。人三叶因子含有三 个成员，分别是三叶因子I(TFFl)、三叶因子2 (TFF2)和三叶因子3 (TFF3)。三叶因子1和 三叶因子3只含有一个三叶因子结构域，而三叶因子2含有两个三叶因子结构域。三叶因 子广泛地分布在胃肠道上皮及其他的上皮系统中，与粘膜保护，损伤修复和肿瘤抑制密切 相关。三叶因子为潜在的肿瘤抑制因子。三叶因子1，2和3均能够促进细胞迁移和伤口修 复，在胃肠道粘膜的损伤修复中起到重要的作用。肿瘤难以治愈的一个主要难题在于肿瘤细胞的恶性转移。肿瘤细胞不断地从一个 器官/组织转移到新的器官/组织，使其病变，坏死，最终威胁生命。胃肠道肿瘤是临床上 的常见病、多发病，严重威胁着人民的生命和健康。我国是世界上胃癌高发国家，全世界约 35%的胃癌病例发生在中国，每年死于胃癌患者超过26万例，占所有癌症死亡的1/5，在我国，大肠癌发病率每年递增4. 2%,比全世界每年递增2%还高一倍，我国结直肠癌患者死 亡率居癌症死亡的第五位。肿瘤的早期诊断和病程检测是临床治疗的重要指标，对于疾病 的治疗和病人的预后非常重要
发明内容
本发明的目的是提供蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途，即两栖类三叶 因子Bm-TFF2和人三叶因子2及它们的衍生结构作为蛋白酶激活受体的激动剂在细胞迁移 及创伤修复制药中的应用，人三叶因子2和蛋白酶激活受体4表达变异在临床胃肠道肿瘤 疾病检测中的应用，可用于生物医学试剂制备，制药和临床检验等领域。本发明的蛋白酶激活受体激动剂的制备方法包括蛋白酶激活受体激动剂的制备 方法包括1)该激动剂是两栖类物种大蹼铃蟾的三叶因子BH1-TFF2、人三叶因子2 ;2)利用 PCR技术获取所需的Bm-TFF2或人三叶因子2基因全序列并将它们分别插入原核表达载体 pET-32a(+)中；3)在大肠杆菌原核表达系统中高效表达了 Bm_TFF2以及人三叶因子2 ；4) 通过对表达菌株裂解液亲和层析得到可溶性融合蛋白TRX-Bm-TFF2以及人三叶因子2 ；5) 融合蛋白经第X因子蛋白酶酶切后再经镍亲和柱纯化，得到纯化的Bm-TFF2以及人三叶因 子2。本发明提供两栖类三叶因子Bm_TFF2以及人三叶因子2的原核表达方法，可用于 Bm-TFF2和人三叶因子2的制备。本发明提供两栖类三叶因子Bm_TFF2作为蛋白酶激活受体1、蛋白酶激活受体2和 蛋白酶激活受体4的新型激动剂，在刺激血小板活化，诱导细胞迁移及创伤修复中的应用， 可用于生物医学试剂制备和制药。本发明提供人三叶因子2作为蛋白酶激活受体4的新型激动剂在刺激细胞迁移及 促进创伤修复中的应用，可用于生物医学试剂制备和制药。本发明提供BH1-TFF2和哺乳类三叶因子衍生序列(Seq Nol-Seq No8)作为蛋白酶 激活受体1和4的新型配体，具有诱导血小板聚集的功能，可用于制备蛋白酶激活受体1和 蛋白酶受体4激动剂。Bm-TFF2和哺乳类三叶因子的衍生序列，其结构如下所示Seq Nol. Gly Phe Pro lie Tyr GluSeq No2. Ser Phe lie Ser Ala Arg Arg AsnSeq No3. Ser Phe Lys Leu Lys GluSeq No4. Ser Phe Lys Pro Gln GluSeq No5. Gly Phe Pro Gly lie ThrSeq No6. Gly Tyr Pro Gly lie SerSeq No7. Gly Phe Pro Gly Val ThrSeq No8. Gly Tyr Pro His Val ThrBm-TFF2和哺乳类三叶因子2的衍生序列作为蛋白酶激活受体的新型配体，在生 物医学试剂制备和制药中的应用。本发明提供人胃癌组织中蛋白酶激活受体4表达显著下调，下调的程度与肿瘤病 程发展呈正相关的趋势。蛋白酶激活受体4作为胃癌检验诊断标志物在临床诊断试剂中的应用，检测胃癌组织中蛋白酶激活受体4的表达可用于临床监测肿瘤病程的发展；三叶因子2和蛋白酶激活受体4在肠癌组织中表达显著上调，二者上调的程度与肿瘤病程发展呈 正相关的趋势。人三叶因子蛋白2和蛋白酶激活受体4作为临床肠癌检验诊断标志物在临 床诊断试剂中的应用，检测肠癌组织中三叶因子2和蛋白酶激活受体4的表达可用于临床 监测肿瘤病程的发展。本发明的积极作用在于通过对三叶因子蛋白和蛋白酶激活受体之间关系的深入 研究，证明了二者存在直接的相互作用。为深入了解这两种蛋白的生物学功能及其机制提 供了有益的帮助。三叶因子及其衍生序列作为蛋白酶激活受体的新型激动剂，在血小板活 化、诱导细胞迁移及创伤修复中发挥了积极的作用。在不同的肿瘤类群中，三叶因子蛋白和 蛋白酶激活受体的表达呈现与病程密切相关的不同表达特征，有益于临床监测肿瘤病程的 发展，为临床诊断和治疗提供帮助。
图1为两栖类三叶因子Bm_TFF2的原核表达、纯化及活性鉴定结果图。图2为两栖类三叶因子Bm_TFF2通过结合蛋白酶激活受体1诱导血小板活化作用 效果图。图3为人三叶因子2通过与蛋白酶激活受体4的相互作用促进的细胞迁移效果 图。图4为Bm_TFF2通过结合蛋白酶激活受体1、蛋白酶激活受体2和蛋白酶激活受体 4诱导细胞迁移效果图。
具体实施例方式实施例1 两栖类三叶因子Bm-TFF2以及人三叶因子2的原核表达及制备(一 )两栖类三叶因子Bm_TFF2质粒构建表达质粒的构建按本领域技术人员熟知的方法进行。编码Bm_TFF2的核酸序列构 建入表达载体pET-32a(+)的方法如下。设计上下游引物，上游引物中引入核酸限制性内切 酶Kpn I位点，Factor Xa切点以及Bm_TFF2的N-末端6个氨基酸残基编码核酸序列，弓丨 物序列为5，-GGTACCATCGAGGGAAGGGGTTTTCCAATCTATGAG-3，；下游引物中引入核酸限制性内 切酶EcoR I位点，中止密码子以及Bm-TFF2的C-末端6个氨基酸残基编码核酸序列，引物 序列为5，-GAATTCTTATTCTTGAGGTTTAAA-3，，利用Bm_TFF2的cDNA作模板扩增，产物酶切后 插入核酸限制性内切酶Kpn I以及EcoR I双酶切的表达载体pET_32a(+)中，转化至表达 菌株大肠杆菌BL21(DE3 plus)(购自Novagen)，挑阳性克隆，测序鉴定。构建的Bm-TFF2核酸序列如下GGTTTTCCAATCTATGAGATAGATAACAGACCTGGATGCTATGTTGACCCTGCAGAGAGAGTTGCATG TGCAGGTGCAGGAGTGACAAAAGCTGAATGCAAGGCTAAAGGCTGCTGTTTTATTTCAGCAAGGAGAAATACAATT TGGTGCTTTAAACTTAAAGAATCAGCGGATGCCTGGAAATGTGCTGTCCCCATGAATACGAGAGTTGCATGCGCT GGCGCAGGTGTCACACCTGCTGAATGCAAGGGAAAAGGTTGTTGTTTCAATTCAAGCTACTATGGAACAGTATGG TGCTTTAAACCTCAAGAATAA对应的表达后Bm-TFF2的氨基酸序列如下
GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTR VACAGAGVTPAECKGKGCCFNSSYYGTVWCFKPQE( 二)两栖类三叶因子Bm-TFF2原核表达及制备测序正确的阳性单克隆菌株接种到5ml LB培养基，37°C培养过夜，将5ml培养 液接种到1升培养基中放大培养，待600nm OD值达到0. 6后，加入0. 5mM IPTG，再培养 3. 5小时后收集菌液，8，OOOg离心10分钟，细菌再用100毫升平衡缓冲液(50mM磷酸钠， pH8. 0，含0. 3M氯化钠和IOmM咪唑)重悬。在冰浴上超声破碎细菌(Ultrasonic Cell CrusherJY92-2D，350W, 60个循环)。16，OOOg离心30分钟后收集上清可溶性部分，过镍亲 和柱，用20倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8. 0含0. 3M氯化钠和20mM咪唑)冲 洗后，用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8. 0，含0. 3M氯化钠和250mM咪唑)洗脱，洗脱得到硫 氧还蛋白(TRX)融合蛋白TRX-Bm-TFF2，融合蛋白经Factor Xa酶切后再经镍亲和柱纯化， 穿透即为 Bm-TFF2。表达的Bm_TFF2经高效液相色谱分析(HPLC)分离图谱，见图1A。利用 抗Bm-TFF2抗血清抗体通过westernblot鉴定表达的Bm_TFF2，见图1B。表达的Bm_TFF2 与天然分离纯化的Bm-TFF2活性基本相当。50nM重组表达的Bm_TFF2能诱导人血小板达到 最大聚集，见图1C。表达的Bm-TFF2经N-末端蛋白质序列测定并结合总分子量质谱测定结 果揭示表达的Bm-TFF2与天然分离纯化的Bm_TFF2具有相同的N-末端蛋白质序列以及相 同的总分子量。(三)人三叶因子2的原核表达及制备人三叶因子2表达质粒的构建、表达及制备工艺与两栖类三叶因子Bm_TFF2完全 相同。构建的人三叶因子2核酸序列如下GAGAAACCCTCCCCCTGCCAGTGCTCCAGGCTGAGCCCCCATAACAGGACGAACTGCGGCTTCCCTGG AATCACCAGTGACCAGTGTTTTGACAATGGATGCTGTTTCGACTCCAGTGTCACTGGGGTCCCCTGGTGTTTCCAC CCCCTCCCAAAGCAAGAGTCGGATCAGTGCGTCATGGAGGTCTCAGACCGAAGAAACTGTGGCTACCCGGGCATC AGCCCCGAGGAATGCGCCTCTCGGAAGTGCTGCTTCTCCAACTTCATCTTTGAAGTGCCCTGGTGCTTCTTCCCG AAGTCTGTGGAAGACTGCCATTAC对应的表达后人三叶因子2的氨基酸序列如下EKPSPCQCSRLSPHNRTNCGFPGITSDQ CFDNGCCFDSSVTGVPWCFHPLPKQESDQCVMEVSDRRNCGYPGISPEECASRKCCFSNFIFEVPWCFFPKSVEDCH Y表达的人三叶因子2经N-末端蛋白质序列测定并结合总分子量质谱测定结果揭 示表达的人三叶因子2与天然分离纯化的人三叶因子2具有相同的N-末端蛋白质序列以 及相同的总分子量。同时，表达的人三叶因子2与天然分离纯化的人三叶因子2具有相似 的诱导细胞迁移活性，说明表达的人三叶因子2具有与天然分离纯化的人三叶因子2相同 的二硫键结合方式。本制备方法的最大优点在于以可溶性蛋白的形式对目的蛋白进行表达，克服了原 核表达常见的目的蛋白不溶现象，通过亲和层析，酶切后再进行亲和层析纯化得到了高活 力的目的蛋白。实施例2 两栖类三叶因子Bm_TFF2是人血小板蛋白酶激活受体1的特异性激动 剂
(一 )血小板洗涤和聚集实验健康人血小板来自云南省血液中心。人血液样品的使用经过云南省卫生厅及血液中心的许可。人血小板用台氏液A液(137mM NaCl, 0. 3mM NaH2PO4,12mM NaHCO3,0. 35% BSA, 2mM EDTA, ImM MgCl2, 5mM葡萄糖，ρΗ 6. 5)悬浮离心(466g)两次后沉淀由台氏液B液 (137mM NaCl, 0. 3mM NaH2PO4,12mM NaHCO3,0. 35% BSA,2mM EGTA, 2mM CaCl2, 5mM 葡萄糖， PH 7.35)悬浮后37°C放置30分钟使其恢复。血小板聚集抑制实验在恒定转速(1100转 /分)转动的血液聚集仪(普利生，北京)上进行分析。洗涤好的血小板用台式液B液稀 释至终浓度为5X108/毫升，300微升反应体系，加各种血小板激动剂{凝血酶、Bm-TFF2、 SFLLRN (PARI受体特异性激动剂)、AYPGKF (PAR4受体特异性激动剂)}，记录5分钟内光吸 收值的变化。对于抑制实验，在反应体系中加入各种抑制剂{SCH-79797 (PARI受体的特异性 抑制剂)、tc-Y-NH2 (PAR4受体的特异性抑制剂)、Plpall2 (PARI受体的特异性抑制剂)、 P4pallO(PAR4受体的特异性抑制剂)，SCH-79797和tc-Y_NH2针对受体的胞外区域，而 Plpall2和P4pall0针对受体的胞内区域产生作用}后，保温10分钟，再加入激动剂，记录 5分钟内的光吸收值的改变，见图2。抑制实验结果证明血小板膜受体PARI被针对受体胞外区域的抑制剂SCH-79797 以及针对受体胞内区域的Plpall2抑制剂抑制后，Bm-TFF2不能引起血小板的聚集，说明 Bm-TFF2通过血小板PARI受体产生作用。( 二 )血小板膜表面受体去敏实验在洗涤好的血小板加入受体激动剂{(凝血酶、Bm-TFF2、SFLLRN (PARI受体特异性 激动剂)、AYPGKF (PAR4受体特异性激动剂)}，静止保温30分钟，然后用台式液A液洗涤两 遍，台式液B液重悬血小板至终浓度为5 X IO8/毫升，300微升反应体系，加各种血小板激动 剂K凝血酶、Bm-TFF2、SFLLRN(PARI受体特异性激动剂)、AYPGKF (PAR4受体特异性激动 齐U )}，记录5分钟内光吸收值的变化，见图2。去敏实验结果表明，当血小板膜受体PARI去敏后，血小板不能被Bm_TFF2所激活， 血小板膜受体PARI的胞外和胞内抑制剂均能完全抑制Bm-TFF2诱导的血小板聚集，说明 Bm-TFF2通过激活血小板上蛋白酶激活受体1来活化血小板。上述实验结果证明Bm_TFF2 通过激活血小板上蛋白酶激活受体1来活化血小板，可用于针对血小板上蛋白酶激活受体 1的生物试剂及药物开发。实施例3 两栖类三叶因子Bm-TFF2与PAR1/PAR2/PAR4作用后诱导细胞迁移细胞迁移活性测定采用Boyden Chamber (Chemicon，美国)系统来进行测定， HT-29细胞购自美国ATCC。具体操作步骤如下1.准备和收集实验细胞转染了针对PARI、PAR2、PAR4的干扰小RNA(siRNA)的 HT-29细胞。过表达蛋白酶激活受体4和空质粒稳定胃癌细胞株AGS培养到约80%满度。 更换细胞培养基为无血清培养基，饥饿细胞约18小时，用非酶消化液(Gibco产品)将细胞 消化5min。收集细胞，离心，弃上清。加入少量无血清培养基重新悬浮细胞。计数，调整细 胞浓度至IXlO6ceIls/毫升。2.细胞迁移将100微升细胞悬液加入到上室里，下室中加入激动剂实验组，包括 EGF 2nM作为阳性对照，0. 25 %牛血清白蛋白作为阴性对照；IOOnM和200nMBm_TFF2。在37°c,5% co2培养箱中孵育18小时后，中止培养。倒置显微镜下，观察并拍照。3.细胞染色和分析用枪头和棉签完全移走chamber室内所有培养基和细胞。使 用试剂盒提供的结晶紫染色液，室温下对细胞染色30分钟。染色结束后，用PBS清洗3次， 并完全浸入去离子水中清洗。倒置显微镜下观察，拍照。加入抽提缓冲液，抽提细胞内色素 结晶紫。分光光度计，586纳米波长读数。计算并比较不同细胞株的细胞迁移率。RNA干扰试验针对PARI、PAR2、PAR4的干扰小RNA(siRNA)购自美国Ambion公司。培养HT-29细胞达到80%满度。去除含血清培养基，利用Lipofectamine 2000，将干扰小RNA转染进 细胞，37°C培养24小时后，去除培养基，加入无血清培养基饥饿细胞24小时后再进行细胞 迁移实验和膜表面受体表达流式检测实验。实验结果表明，PARI、PAR2、PAR4干扰后对Bm_TFF2诱导的细胞迁移都有抑制作 用，PAR2干扰的抑制率最强。Bm-TFF2对细胞迁移的诱导作用可用于促进伤口修复相关药 物的开发。实施例4 两栖类三叶因子Bm-TFF2衍生序列诱导血小板聚集。血小板洗涤和聚集实验健康人血小板来自云南省血液中心。人血液样品的使用经过云南省卫生厅及血 液中心的许可。人血小板用台氏液A液(137mM NaCl, 0. 3mM NaH2PO4,12mM NaHCO3,0. 35% BSA, 2mM EDTA, ImM MgCl2, 5mM葡萄糖，ρΗ 6. 5)悬浮离心(466g)两次后沉淀由台氏液B液 (137mM NaCl, 0. 3mM NaH2PO4,12mM NaHCO3,0. 35% BSA, 2mM EGTA, 2mM CaCl2, 5mM 葡萄糖， PH 7. 35)悬浮后37°C放置30分钟使其恢复。血小板聚集抑制实验在恒定转速(1100转/ 分)转动的血液聚集仪(普利生，北京)上进行分析。洗涤好的血小板用台式液b液稀释至 终浓度为5 X IO8/毫升，300微升反应体系，加两栖类三叶因子Bm-TFF2衍生序列肽，记录5 分钟内光吸收值的变化。BM-TFF2的蛋白质序列如下所示，加框氨基酸残基代表了 BM-TFF2 衍生肽的模板结构及其在BM-TFF2分子中的位置。BM-TFF2 igfpiyei idnrpgcyvdpaervacagagvtkaeckakgc [cfisarrnf tiw ]cfklke| sadawk CAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFNSSYYGTVff IcfkpqeI实验结果表明，Bm-TFF2衍生序列肽 GFPIYE (Seq Nol)，SFISARRN (Seq No2)， SFKLKE (Seq No3), SFKPQE (Seq No4)能够诱导人血小板聚集。实施例5 在细胞上，人三叶因子和蛋白酶激活受体4的相互作用促进细胞迁移和 创伤修复。(一 )细胞迁移活性测定采用Boyden Chamber (Chemicon，美国)系统来测定细胞迁移活性，所用的胃癌细 胞株AGS本身不表达PAR4，具体操作步骤如下1.准备和收集实验细胞过表达蛋白酶激活受体4和空质粒稳定胃癌细胞株AGS 培养到约80%满度。更换细胞培养基为无血清培养基，饥饿细胞约18小时，将细胞消化 5min。加入足量Quenching Medium中和消化液中的胰酶和EDTA。离心，弃上清。加入少量 Quenching Medium重新悬浮细胞。计数，调整细胞浓度至2. 5X IO6ceIls/毫升。2.细胞迁移将100微升细胞悬液加入到上室里，下室中加入激动剂实验组，包括EGF 2nM作为阳性对照，0.25%牛血清白蛋白作为阴性对照；人三叶因子激动剂实验组剂 量分别为50nM、100nM和200nM。在37°C、5% CO2培养箱中孵育18小时。中止培养。倒置 显微镜下，拍照。3.细胞染色和分析用枪头和棉签完全移走chamber室内槽里面的所有培养基和 细胞。使用试剂盒提供的结晶紫染色液，室温下对细胞染色30分钟。染色结束后，用PBS 清洗3次，并完全浸入去离子水中清洗。倒置显微镜下，拍照。加入抽提缓冲液，抽提细胞 内色素结晶紫。分光光度计，586纳米波长读数。计算并比较不同细胞株的细胞迁移率。实验结果表明人三叶因子能剂量依赖地显著提高过表达蛋白酶激活受体4的2 株胃癌细胞AGS的细胞迁移活性。加入PAR4受体的特异性抑制剂P4pall0(针对受体的胞 内区域产生作用)后，200nM人三叶因子TFF2对过表达蛋白酶激活受体4的2株胃癌细胞 AGS的细胞迁移活性大大降低，揭示人三叶因子2通过与蛋白酶激活受体4的相互作用促进 的细胞迁移，见图3。该特点可用于促进伤口修复相关药物的开发。 ( 二)伤口修复活性测定采用人工划伤模型来测定人三叶因子2的体外伤口修复 活性，具体操作步骤如下1.消化并收集过表达蛋白酶激活受体4(PAR4)和空质粒(mock)稳定胃癌细胞株 AGS,调整细胞浓度为1 X IO6个/毫升。接种2ml细胞悬液至35毫米培养皿中，在37°C、5% CO2培养箱中过夜培养。2.倒置显微镜下，观察至细胞完全贴壁，铺满培养板底。3.用1毫升枪头划线，造成人工的“伤口”模型。无血清培养基清洗去除漂浮的、 死亡的细胞，更换培养基为饥饿培养基。在37°C、5%C02培养箱中稳定2小时。倒置显微 镜下，拍照。4.在培养皿中，加入011]\1，10011]\1，1011]\1的人三叶因子2，1011]\1 EGF作为阳性对照，
0.25%牛血清白蛋白设为阴性对照。在37°0、5%0)2培养箱中孵育。每隔24小时，更换一 次饥饿培养基，并补充药物至相应的浓度；倒置显微镜下，拍照，记录下“伤口 ”的闭合情况。5.持续观察72小时。6.以上的实验重复3次以上，图4为代表性的一组实验结果。实验结果表明，人三叶因子2能够诱导表达蛋白酶激活受体4的稳定胃癌细胞株 AGS的细胞迁移和伤口修复(PAR4组)。而对稳定转染空质粒的胃癌AGS细胞株没有作用 (mock组)，见图4。因此，人三叶因子2可用于通过促进细胞迁移来增强伤口修复的药物的 开发。实施例6 哺乳动物三叶因子衍生物诱导血小板聚集。血小板洗涤和聚集实验健康人血小板来自云南省血液中心。人血液样品的使用经过云南省卫生厅及血 液中心的许可。人血小板用台氏液A液(137mM NaCl, 0. 3mM NaH2PO4，12mM NaHCO3,0. 35% BSA, 2mM EDTA, ImM MgCl2, 5mM葡萄糖，pH 6. 5)悬浮离心(466g)两次后沉淀由台氏液B液 (137mM NaCl, 0. 3mM NaH2PO4,12mM NaHCO3,0. 35% BSA,2mM EGTA, 2mM CaCl2, 5mM 葡萄糖， PH 7. 35)悬浮后37°C放置30分钟使其恢复。血小板聚集抑制实验在恒定转速(1100转/ 分)转动的血液聚集仪(普利生，北京)上进行分析。洗涤好的血小板用台式液B液稀释 至终浓度为5 X IO8/毫升，300微升反应体系，加各种三叶因子衍生物，记录5分钟内光吸收值的变化，并以此为对照。哺乳动物三叶因子序列比对结果如下 合成的人和猪三叶因子衍生物为GFPGIT (Seq No5)，GYPGIS (Seq No6)， GFPGVT(Seq No7)，GYPHVT(Seq No8)。实验结果表明，合成的上述哺乳动物三叶因子衍生物能够诱导血小板聚集，可用 于血小板激动剂试剂的制备。实施例7 胃癌组织切片染色和荧光定量PCR检测发现胃癌组织中蛋白酶激活受 体4表达下调及在胃癌未发生淋巴结转移与已发生淋巴结转移病人之间存在显著性差异(一 )免疫组织化学检测组织芯片购自上海芯超公司，每张芯片包括31对石蜡包埋的人胃癌和癌旁组织 样本。芯片脱蜡脱水后，通过高压锅121°C抗原修复5分钟，用3%双氧水处理10分钟以 去除内源过氧化氢酶的活性。芯片用正常兔血清封闭30分钟后与相应的一抗4°C孵育过 夜，抗人蛋白酶激活受体4抗体(美国Santa Cruz) (1比1200稀释)，正常羊IgG(美国 SantaCruz) (1比2400稀释)芯片洗涤后加入相应的二抗，链霉素-生物素-过氧化氢酶体 系(福建迈新公司)进行。芯片再用哈氏液复染细胞核，利用莱卡免疫组化IM50软件采集 图片并进行分析。实验结果表明胃癌组织相对正常组织PAR4的表达明显下调。( 二)实时定量荧光PCR检测从昆明医学院各大附属医院共获得18例胃癌患者癌组织及周围正常对照组织。 经液氮速冻后转移至-80°C低温冰箱保存至RNA提取。采用硫氰酸胍迅速溶解蛋白质，导致 细胞结构破碎致使蛋白与核酸分离，β-巯基乙醇破坏RNase的活性，保护RNA不被降解。 同时配合DNaseI去除产物中残留的DNA和二氧化硅特异性吸附核酸的特性来提取组织中 高纯度的总RNA，继而通过逆转录过程获得相应的cDNA。设计蛋白酶激活受体4(PAR4)的 正向引物 5，-CCTTCATCTACTACTACGTGTCG-3，，反向引物 5，-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3’ (147 bp)，用SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA公司产品)来扩增内参和目的基因，通过软件用 手动方法获取各基因达到相同阈值时对应的CT，最后用C值法获得两个基因在癌样品 中与正常对照表达的差异。表1.荧光定量PCR检测胃癌组织中蛋白酶激活受体4的表达水平 实验结果表明，胃癌组织中蛋白酶激活受体4表达显著下调，下调的程度与肿瘤 病程发展呈正相关的趋势，如去分化程度，临床分期，肿瘤转移(种植性转移和淋巴结转 移)及肿瘤分型；特别是下调程度在胃癌已发生淋巴结转移与未发生淋巴结转移病人之间 存在显著性差异(P < 0. 05)，可用于临床检测肿瘤病程的发展。实施例8 染色和荧光定量PCR检测发现在肠癌组织上三叶因子2和蛋白酶激活 受体4表达共定位和上调及与肿瘤病程发展呈正相关的趋势(一 )免疫组织化学检测组织芯片购自上海芯超公司，每张芯片包括31对石蜡包埋的人肠癌和癌旁组织 样本。芯片脱蜡脱水后，通过高压锅121°C抗原修复5分钟，用3%双氧水处理10分钟以 去除内源过氧化氢酶的活性。芯片用正常兔血清封闭30分钟后与相应的一抗4°C孵育过 夜，即抗人三叶因子2抗体(美国Santa Cruz) (1比200稀释)，抗人蛋白酶4抗体(美国 SantaCruz) (1比1200稀释)，正常羊IgG(美国Santa Cruz) (1比2400稀释)芯片洗涤后 加入相应的二抗，链霉素-生物素-过氧化氢酶体系(福建迈新公司)进行。芯片再用哈 氏液复染细胞核，利用莱卡免疫组化IM50软件采集图片并进行分析。实验结果表明肠癌 组织相对正常组织人三叶因子2以及PAR4的表达明显上升。( 二)实时定量荧光PCR检测从昆明医学院各大附属医院共获得38例肠癌患者癌组织及周围正常对照组织。 经液氮速冻后转移至-80°C低温冰箱保存至RNA提取。采用硫氰酸胍迅速溶解蛋白质，导致 细胞结构破碎致使蛋白与核酸分离，β-巯基乙醇破坏RNase的活性，保护RNA不被降解。 同时配合DNaseI去除产物中残留的DNA和二氧化硅特异性吸附核酸的特性来提取组织中 高纯度的总RNA，继而通过逆转录过程获得相应的cDNA。分别设计蛋白酶激活受体4(PAR4) 的正向引物 5，-CCTTCATCTACTACTACGTGTCG-3，，反向引物 5，-ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG-3 ’ (147bp)和三叶因子(TFF2)的正向引物5，-CTGCTTCTCCAACTTCATCT_3，，TFF2的反向引物S'-TTAGTAATGGCAGTCTTCCA-S ， (74bp) ， 用 SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA 公司产品)来扩增 内参和目的基因，通过软件用手动方法获取各基因达到相同阈值时对应的CT，最后用2-δ" 值法获得两个基因在癌样品中与正常对照表达的差异。表2荧光定量PCR检测肠癌组织中三叶因子2和蛋白酶激活受体4的表达 实验结果表明，三叶因子2和蛋白酶激活受体4在肠癌患者中的表达显著上调，二 者上调的程度与肿瘤病程发展呈正相关的趋势，如去分化程度，临床分期，肿瘤转移(种植 性转移、淋巴结转移和血道转移)，特别是在低_中分化与高分化病人之间上调程度存在极 显著性差异(P < 0.001)，已发生淋巴结转移与未发生淋巴结转移病人之间存在显著性差 异(P < 0. 05)，可用于临床检测肿瘤病程的发展。
权利要求
一种蛋白酶激活受体激动剂的制备方法，其特征在于包括1)该激动剂是两栖类物种大蹼铃蟾的三叶因子Bm-TFF2、人三叶因子2；2)利用PCR技术获取所需的Bm-TFF2或人三叶因子2基因全序列并将它们分别插入原核表达载体pET-32a(+)中；3)在大肠杆菌原核表达系统中高效表达了Bm-TFF2以及人三叶因子2；4)通过对表达菌株裂解液亲和层析得到可溶性融合蛋白TRX-Bm-TFF2以及人三叶因子2；5)融合蛋白经第X因子蛋白酶酶切后再经镍亲和柱纯化，得到纯化的Bm-TFF2以及人三叶因子2。
2.一种蛋白酶激活受体激动剂的用途，其特征在于蛋白酶激活受体激动剂Bm-TFF2 作为蛋白酶激活受体1、蛋白酶激活受体2和蛋白酶激活受体4的激动剂在蛋白酶激活受体 检测试剂和制药中的应用。
3.一种蛋白酶激活受体激动剂的用途，其特征在于所述的蛋白酶激活受体4作为胃 癌检验诊断标志物在临床诊断试剂中的应用。
4.一种蛋白酶激活受体激动剂的用途，其特征在于所述蛋白酶激活受体激动剂中的 人三叶因子2作为蛋白酶激活受体4的激动剂在细胞迁移及创伤修复中的应用。
5.一种蛋白酶激活受体激动剂的用途，其特征在于所述蛋白酶激活受体激动剂中的 人三叶因子蛋白2和蛋白酶激活受体4作为临床肠癌检验诊断标志物在临床诊断试剂中的 应用。
6.如权利要求2、3、4或5所述的蛋白酶激活受体激动剂的用途，其特征在于所述的 Bm-TFF2和哺乳类三叶因子2的衍生序列，其结构如下所示Seq Nol. Gly PheProlie Tyr GluSeq No2. Ser PhelieSer Ala Arg Arg AsnSeq No3. Ser PheLysLeu Lys GluSeq No4. Ser PheLysPro Gin GluSeq No5. Gly PheProGly lie ThrSeq No6. Gly TyrProGly lie SerSeq No7. Gly PheProGly Val ThrSeq No8. Gly TyrProHis Val Thr0
7.根据权利要求6所述的蛋白酶激活受体激动剂的用途，其特征在于所述的Bm-TFF2和哺乳类三叶因子2的衍生序列作为蛋白酶激活受体的新型配体，在生物医学试剂制备和 制药中的应用。
全文摘要
本发明提供蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途，即两栖类三叶因子Bm-TFF2作为人蛋白酶激活受体1、蛋白酶激活受体2和蛋白酶激活受体4的新型激动剂，人三叶因子2作为蛋白酶激活受体4的新型激动剂，以及它们的衍生结构作为蛋白酶激活受体1和4的新型激动剂在刺激血小板活化，诱导细胞迁移及促进创伤修复中的应用。提供检测人胃癌组织中蛋白酶激活受体4表达，检测三叶因子2和蛋白酶激活受体4在肠癌组织中的表达用于临床监测肿瘤病程的发展。可用于生物医学试剂制备、制药和临床检验等领域。证明了三叶因子蛋白和蛋白酶激活受体之间存在直接的相互作用，为深入了解这两种蛋白的生物学功能及其机制提供了有益的帮助。有益于临床监测肿瘤病程的发展，为临床诊断和治疗提供帮助。
文档编号G01N21/64GK101870974SQ20101018333
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者余果宇, 张云, 张勇, 李文辉, 江萍, 王严戒 申请人:中国科学院昆明动物研究所