专利名称：一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程检测技术领域，具体涉及临床标本中结核分枝杆菌复合群的 荧光定量检测方法。
背景技术：
结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆 菌。结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外， 少数人类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较弱，是热带非洲人结核病病原体。田 鼠分枝杆菌对人类无致病性。结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自20世纪90年代以来结核病在全 球“死灰复燃”，许多国家包括结核病疫情控制较好的国家，不同程度地出现了疫情下降缓 慢或严重反弹的局面，发病率以每年1.的速度增长，结核病再次成为威胁人类健康的主 要传染病，成为严重的公共卫生问题和重大的经济社会问题。据世界卫生组织估计，全球每 年新发结核病患者880万例，其中传染性结核病患者390万例，每年因结核病死亡的患者约 200万人。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二位。 每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。如果不采取有效措 施，在未来的10年中，可能有3000万人发生结核病。临床诊断肺结核的主要依据是检测痰中结核分枝杆菌，其中，涂片法简单易行，但 阳性率较低；罗氏培养法虽然是金标准，但检测周期长，均难以满足临床需要。因此提供敏 感、特异、快速、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技术已成为国内外研究的重点。其 中实时荧光PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床中。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特 异性荧光探针(TaqMan探针)，探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，利 用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。目前常用的TaqMan探针为寡核苷酸，其5'端标 记有报告基团(Importer，R)，如FAM、VIC等，3 ‘端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)， 如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不 到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3' -5'外 切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信 号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程， 每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度 标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可 对未知模板进行定量分析。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种检测灵敏度高、且操作简 单的结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法。
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本发明提供的结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法，通过对RDP ( Ribosomal Database Project)中结核分枝杆菌复合群的16srRNA全序列进行生物信息学 比对分析，选取序列保守片段为靶目标，应用primer express软件和primer premier 5.0 软件，设计一条逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针。本发明方法所用的结核 分枝杆菌复合群特异性定量检测试剂包含一条逆转录引物和一对特异性PCR引物以及一 条特异性荧光探针，扩增目的扩增片段长度为100 bp。本发明方法包括如下步骤
1.通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌复合群的16srRNA基因的保守片段为靶目 标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为
GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCT ATCAGCTTGTTGGTG GGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG (SEQ ID NO. 5)
2.应用primerexpress软件禾口 primer premier 5. O软件，设计一条结核分支杆菌复 合群的逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针。探针5’端的荧光报告基团是 FAM, 3'端标记的是荧光淬灭基团为TAMRA。逆转录引物CCGTATCTCAGTCCCAGTGT(SEQ ID NO. 1) 上游引物MTBC-F GGGATGCATGTCTTGTGGTG (SEQ ID NO. 2) 下游引物MTBC-R CCGTCGTCGCCTTGGTAG (SEQ ID NO. 3)
Taqman 探针序列5' -FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3，。(SEQ ID N0. 4)
3.构建和制备质粒定量标准品
根据确定的PCR产物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体 PGEM-T Easy Vector中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌复合群的定量标准品。4.样本中结核分枝杆菌复合群的分离及其核酸的提取，使提取的样本中同时含有 DNA与RNA成分；
5.对提取的同一样本同时进行RT-PCR和PCR，计算出起始样本RT-PCR/PCR的拷贝数 比值，从而区分样本中死菌与活菌。6.结核分支杆菌复合群特异性定量检测方法的优化和建立
经过大量的反应条件优化、对比试验和验证试验，并经过临床样本的检测应用评估。对 建立的方法进行灵敏度、稳定性、特异性以及对临床样本的有效性进行综合评价
(1)灵敏度用TE分别将质粒定量标准品PGEM-T Easy-16srRNA稀释至101(1、ΙΟ9、108、 IO7,IO6,IO5,10\IO3,IO2,10\ 0°οορ β8/π1,采用经优化后的体系进行检测，验证所建立的 方法的灵敏度。本检测方法在IOltl-IO2 copies/reaction数量级范围内具有良好的线性关 系，相关系数R=O. 9937，其检测范围可达9个数量级。(2)稳定性我们从批间重复和批内重复两个方面进行评价。批内重复性选取 同一份样本设5个平行反应管同时进行反应，检测其CT值及比值的变异系数。批间重复性 选取同一份样本，一周内重复检测5次，检测其CT值及比值的变异系数。(3)特异性本研究选取了 5个人的基因组DNA样本进行检测，结果只有结核分支 杆菌复合群样本呈阳性结果，5份人的基因组DNA均为阴性结果。本发明采用的荧光定量PCR技术巧妙的利用了 PCR技术的高效扩增、探针技术的 高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，检测灵敏度可达IO2数量级；并且缩短了实验时间， 简化了实验操作，而且荧光检测的结果由电脑软件分析，避免了产物后处理过程所致的污 染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。同时，本发明中采用的阳性对照是根据结核分支杆菌 复合群的保守序列设计构建的标准质粒分子，使得阳性标准品德来源可靠，避免了阳性毒 株在每次实验中的使用。本发明方法可进行大批量的样本分析，并对结核分枝杆菌复合群 进行定量，从而为结核分支杆菌复合群的检测和监控提供有效方法。
图1为荧光定量PCR敏感度检测的荧光信号图(从左到右的标准品浓度分别为 IO10-IO0 copies/ul)。图2 为结核分支杆菌复合群的绝对定量的标准曲线， Y=-3. 3592*log(conc)+38. 4939
(注conC表示反应体系中的标准质粒拷贝数)。
具体实施例方式下面结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明要求保护的范围。实施例1 设计引物和Taqman探针 实验步骤
在RDP ( Ribosomal Database Project)核糖体序列分析数据库中检索结核分枝杆 菌复合群的16srRNA全序列，通过生物信息学比对分析，选取序列保守片段，应用primer express软件和primer premier 5. O软件，设计一条逆转录引物和一对PCR引物以及一条 Taqman探针，探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团为TAMRA，引物 和探针位于结核分枝杆菌复合群16srRNA区域，目的扩增片段为100 bp。引物和探针序列为
逆转录引物CCGTATCTCAGTCCCAGTGT
上游引物MTBC-F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG
下游引物MTBC-R CCGTCGTCGCCTTGGTAG
Taqman 探针序列5' -FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3'。实施例2:定量标准品的构建与制备 实施步骤
1.定量标准品的构建
利用RT-PCR方法克隆得到含有靶序列的结核分支杆菌复合群(MTBC)基因片段，重组 到质粒载体PGEM-T Easy中，并进行DNA序列测定。构建的重组质粒作为检测结核分枝杆 菌复合群的定量标准品，命名为pGEM-T Easy-16srRNA。2.定量标准品的制备
质粒pGEM-T Easy-16srRNA经过提取纯化后，根据紫外分光光度计测定的0D260、 0D280和0D230值计算质粒浓度，检测质粒的纯度，并根据阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。计算公式如下
5质粒浓度(ug/ul)= 0D260 X稀释倍数X50/1000
质粒拷贝数=A*N/1000M
Α:代表质粒浓度(ug/ul)；
M:代表质粒分子量；
N:代表阿伏伽德罗常数(6. 02xl023/mol)
实施例3 痰液样本中细菌的分离与提取
1.痰液样本的预处理
(1)取晨痰置于无菌密封瓶，采用NaOH处理法。(2)加入等体积10%Na0H溶液，涡旋震荡混勻后，置37°C水浴消化30 min以上，直 至痰液被完全消化为止；
(3)混勻痰消化液，取1ml液化痰标本于洁净的1. 5mlEP管中12000 rpm离心5min后 去上清；
(4)再用Iml清洗液(IOmMEDTA或生理盐水)洗涤上一步的沉淀，涡旋震荡混勻后， 12000 rpm离心5min后去上清留沉淀待检。2.运用一种新的抽提方法同时提取细菌中的RNA与DNA
(1)细菌裂解将上一步痰液样本预处理后所得沉淀物重新悬浮于Iml裂解液中，该裂 解液由IX混合液和酚氯仿异戊醇(25:24:1)等体积组成。(2)运用MiniBeadbeater-I研磨珠均质器进一步裂解结核杆菌细胞壁， MiniBeadbeater-I研磨珠均质器的条件是4800rpm，30s，放液氮或冰上5_10s后，再重复一次。(3)核酸抽提先稍微离心上一步的菌体裂解液，吸取上清液到1. 5mlEP管中(勿 吸到下层的陶瓷微珠)。(4)沉淀先加入4uL微量核酸助沉剂，充分混勻，再加入等体积的异丙醇，混勻， 冰上放置 30min。12000rpm，IOmin 离心。(5)洗涤沉淀用75%的乙醇洗涤，晾干后，溶于适量的Rnase-freeMilli-Q水中。(注1X混合液由2X TE Buffer与2X异硫氰酸胍等体积混合而成； 2XTE Buffer 的配方组成浓度20mM Tris-HCl 2mM EDTA PH=8. 0
2X异硫氰酸胍的配方组成浓度2mM硫氰酸胍2mM硫氰酸铵) 实施例4 用上述新的核酸抽提方法提取1-5号临床样本的总RNA及DNA，然后先从5 管样本中各取出5ul核酸模板进行下面的逆转录反应。实验步骤
1.反应体系配置使用反转录反应试剂对样本进行反转录反应，反转录反应体系 为 10μ1,其中 5 X First-Strand Buffer 2 μ 1, M-MLV RT Enzyme 0· 1 μ 1、IOmMdNTP 皿士乂0.25111特异反转录引物0.5 4 1、核酸模板5 4 1，补8妝86 Free dH20至总体积为10 μ 1。2.反应程序的设置
(1)先加dNTPMix、特异反转录引物、核酸模板、RNase Free dH20
(2)65°C 5分钟，然后放冰上冷却片刻
(3)再加5 X First-Strand Buffer ,37 °C 2 分钟
(4)最后加酶，37°C50分钟一70°C 15分钟。
实施例5 结核分枝杆菌复合群特异性定量PCR方法的优化和建立 实验步骤
1.绝对定量标准曲线的建立 (1)质粒标准品制备
质粒pGEM-T Easy-16srRNA经过提取纯化后，根据紫外分光光度计测定的0D260、 0D280和0D230值计算质粒浓度，检测质粒的纯度，并根据阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。(2)定量PCR反应条件的优化
通过对反应体系中不同浓度的定量PCR引物、Taqman探针、以及退火温度等实验结果 进行比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲线、反应效 率接近于1的反应体系。本发明使用的荧光定量PCR仪为ABI7900。荧光检测的程序设置 在每个循环第二步结束时检测荧光信号。引物浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将MTBC的PCR引物浓度 从0. lumol/L至0. 5 umol/L以0. 05 umol/L递增，通过试验结果分析比较，确定最佳的引 物终浓度为0. 3 umol/L。探针浓度优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将MTBC的探针浓度分别从 0. lumol/L至0.8 umol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果分析比较，确定最佳 的引物终浓度为0.4 umol/L。退火温度优化通过比较退火温度的优化试验结果后，选定60°C为最佳退火温度。经优化后的定量PCR反应体系PCR扩增反应体系为10ul，其中包括2xmaSter mix 5ul、Taqman probe (4umol/L) lul、PCR 上游引物(5umol/L) 0. 6ul、PCR 下游引物 (5umol/L) 0. 6ul、原始样本的逆转录产物1 μ 1、未经逆转录反应的原始样本0. 5 μ 1 (保证 原始样本的逆转录产物和未经逆转录反应的原始样本中的起始DNA量一致)，补ddH20至终 体积为10 μ 1 ；
PCR反应程序95°C 10分钟(1个循环)一950C 15秒，60°C 1分钟(40个循环)
(3)绝对定量的扩增曲线建立
用TE 10倍梯度稀释质粒定量标准品pGEM-T Easy-iesrRNA，稀释后质粒浓度分别为 IO10、ΙΟ9、ΙΟ8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102,10\ 0°οορ β8/π1。采用经优化后的体系进行反应， 反应条件为95°C 10分钟(1个循环)一95°C 15秒，60°C 1分钟(40个循环)。检测结束 后利用荧光PCR自带的软件，根据噪声情况设定和调整基线和阈值，绘制标准曲线(图1)。2.灵敏度分析
本检测方法在IOltl-IO2 copies/reaction数量级范围内具有良好的线性关系，相关系 数R=O. 9937，其检测范围可达9个数量级(图2)。检测反应管中起始模板的拷贝数的计算公式M :conc=10(38-4939-CT)/3·3592
若样本1经过RT-PCR后的CT值为X，则通过代入上式M可以得到样本1中起始总RNA 与 DNA 的拷贝数为 10(38·4939- /3·3592
若样本1未经过RT反应，直接进行PCR反应后的CT值为Y，则通过代入上式M可以得 到样本1中起始DNA的拷贝数为10 -γ)/3_·
因此可以推算出样本1中RT-PCR/PCR的拷贝数比值为10(38 4939_ /33592 /
权利要求
一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT PCR检测方法，其特征在于具体步骤如下(1)结核分枝杆菌复合群特异性定量RT PCR引物和探针设计在RDP核糖体序列分析数据库中检索结核分枝杆菌复合群的16srRNA全序列，通过生物信息学比对分析,选取序列保守片段，设计一条逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针，探针5'端的荧光报告基团是FAM，3'端标记的是荧光淬灭基团为TAMRA，引物和探针位于结核分枝杆菌复合群16srRNA区域，目的扩增片段为100 bp，扩增序列为GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG引物和探针序列为逆转录引物CCGTATCTCAGTCCCAGTGT上游引物MTBC F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG下游引物MTBC R: CCGTCGTCGCCTTGGTAGTaqman探针序列5' FAM CGGGCTCATCCCACACCGCTA TAMRA 3'；(2)定量标准品的构建根据确定的PCR产物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pGEM T Easy 中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌复合群的定量标准品；(3)样本中结核分枝杆菌复合群的分离及其核酸的提取，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；(4)对提取的同一例样本分别进行RT PCR和PCR，计算出起始样本中RT PCR/PCR的拷贝数比值，从而区分样本中死菌与活菌。
2.一种结核分枝杆菌复合群特异性定量RT-PCR引物和探针，扩增序列为 GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCT ATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG其特征在于逆转录引物为CCGTATCTCAGTCCCAGTGT上游引物为MTBC-F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG下游引物为MTBC-R: CCGTCGTCGCCTTGGTAGTaqman 探针序列为5，-FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3，。
全文摘要
本发明属于生物工程检测技术领域，具体为一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法。本发明包括如下步骤结核分枝杆菌复合群特异性定量RT-PCR引物和探针设计；标准分子的构建；细菌样本RNA与DNA的共同提取；对同一份样本分别进行RT-PCR和PCR；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。用本发明的方法检测结核分支杆菌复合群具有快速简单、灵敏度高、特异性强、且能区分死菌与活菌的优点，解决了现有检测方法中检测周期长、阳性率低、不能区分死活菌的不足，具有重要的的实际应用价值。
文档编号G01N21/64GK101974630SQ201010522800
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者吴伟, 姜丽娟, 李瑶 申请人:复旦大学