专利名称：一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒及制备方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)13:^1 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的猪的一种高度传染性疾病。自2006年我国爆发了由PRRSV变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)，其与经典猪繁殖与呼吸综合征相比，主要表现为发病猪持续高温41°C以上；各年龄段猪均可出现急性死亡；母猪流产率可达30%以上；仔猪表现为发病率高达100%，死亡率高达50%以上。我国农业部于2008年底将其列为一类动物传染病。目前国内对PRRS的防控主要采取疫苗免疫为主，使猪群产生免疫抗体以抵御 PRRS侵袭，降低养猪场的风险。而当前部分猪场在免疫PRRS疫苗后，猪群仍有PRRS发生。 因此能合理客观及时评估猪场PRRS疫苗免疫效果，为猪群PRRS防控提供科学依据显得尤为重要。PRRS疫苗免疫机体后产生中和抗体及非中和抗体，其中中和抗体能够与病毒表面的抗原结合，从而阻止该病毒黏附机体靶细胞受体。故猪体内始终保持一定水平的PRRSV 中和抗体，对于维持猪群健康具有重要意义。目前已经证明PRRSV结构蛋白中可以产生特异性中和抗体的有GP3、GP4和GP5蛋白，M蛋白也可能产生中和抗体，其中GP5蛋白被公认为是机体产生保护性体液免疫的主要蛋白。通过对国内市场使用的PRRS血清抗体检测试剂盒调查显示，主要有PRRS全病毒蛋白和N蛋白为抗原包被的ELISA检测试剂盒。前者可检测PRRSV的各种抗体水平，能够全面体现PRRSV抗体总水平；后者则检测PRRSV N蛋白的抗体，可以体现早期抗体及主要结构蛋白N抗体水平，但是均不能有效说明机体内特异性中和抗体水平，不能客观地体现机体抵抗病毒的能力和疫苗免疫效果。因此有必要开发出一种能检测PRRSV GP5蛋白产生的特异性抗体的商品化试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，选取核苷酸同源性较高的HP PRRSV GZJL株，通过 PRRSV GP5基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物PRRSV GP5蛋白的iELISA 方法，并进行条件优化，以便制备成商品化iELISA试剂盒。该iELISA试剂盒的发明，将为 PRRS疫苗免疫效果的评价，提供一种更加客观和有效的指标，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，为PRRS的免疫防控提供技术支撑。基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒其组成包括50 200 μ L重组蛋白包被、包被缓冲液 25mL-40mL、酶标二抗 300-500 μ L、IXPBST 缓冲液 800mL-1000mL、阳性对照 lmL、 阴性对照lmL、封闭缓冲液25mL-40mL、底物液A10mL_15mL、底物液B10mL_15mL和终止液10mL-15mLo所述的重组蛋白包被为重组蛋白使用包被缓冲液稀释为1.8 mg/100yL 3 mg/lOOyL;重组蛋白为PRRSV GP5基因通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达系统获得GP5蛋白， 并通过His · Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白；包被缓冲液为=Na2CO3 1.59 g^NaHCO3 2.93 g溶于去离子水中，定容至1000 mL,调至 ρ H 9. 5 9. 8。所述的酶标二抗为羊抗猪IgG-HRP。所述的IXPBST 缓冲液为NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g,KH2PO4 0. 2 g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9 g、Tween-20 0. 5 mL 溶于 800 mL 蒸溜水，调整 pH 为 7. 2 7. 6，定容至 1000 mL。所述的阳性对照为通过PRRS分离毒临床感染猪获得的高免血清，使用时用血清稀释液按1 10 1 200倍稀释；所述的阴性对照为未感染且未免PRRS疫苗的猪血清，稀释度为 1:10 1:200。所述的封闭缓冲液为=BSAO. 3 g (0. 1 0. 5 g)溶于100 mL PBST缓冲液；所述底物液A为Na2HPO4 14. 60 g、柠檬酸9.33 g和过氧化氢脲0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1000 mL，调至ρ H 5. 0 5. 4 ；所述底物液B为TMB 20mg和无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装。所述的终止液为0. 2 % 0. 3% HF溶液。基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，它包括以下步骤 第一，原核表达系统表达融合蛋白His-dGP5，并经His · Bind Purification Kit 纯化得到融合蛋白，应用SDS-PAGE和Western-blotting分析其纯化效果及反应原
性；
第二，步骤一的纯化融合蛋白His-dGP5作为包被抗原，进行抗原包被液浓度、抗原包被条件、封闭液、血清稀释度、封闭时间、酶标二抗稀释浓度和显色反应时间iELISA的条件的优化；
第三，取40份已知PRRS抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行 iELISA反应。样本OD63tl值>阴性样本OD63tl值的平均值(X) +3 (标准差)，可在99%的水平上判为阳性，当样本OD63tl值<阴性样本OD63tl值的平均值(X) +3 (标准差)时，判为阴性。本发明有益效果本发明方法适用于检测猪血清PRRSV GP5 IgG，能够体现机体内中和抗体水平，将为PRRS疫苗免疫效果的评价，提供一种更加客观和有效的指标，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，为PRRS的免疫防控提供技术支撑。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果
(1)效果好GP5抗体水平能够较好的体现机体抵抗PRRSV侵袭和疫苗免疫效果，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，降低猪场的生产成本。(2)相对于进口的全病毒包被ELISA试剂盒约5000元的销售价格，本发
明的PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒单个成本价仅500元，能够极大降低PRRS血清抗体监测成本。
图1为本发明的PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒制备生产流程图。
具体实施例方式
具体实施例方式
基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒原料组成为
PRRS标准阳性和标准阴性血清；重组蛋白为PRRSV GP5基因通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达系统获得GP5蛋白，并通过His · Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.8 mg/100yL ^3 mg/ΙΟΟμ L ；包被缓冲液=Na2CO3 1. 59g、NaHCO3 2. 93g溶于去离子水中，定容至IOOOmL, il 至 ρ H9. 6 ；酶标二抗羊抗猪 IgG-HRP ；IXPBST 缓冲液NaCl 8. 0g、KCl 0. 2g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、Tween-20 0. 5mL 溶于 800mL 蒸馏水，调整 pH 为 7. 4，定容至 IOOOmL ；封闭缓冲液=BSAO. 3g溶于IOmL PBST缓冲液；底物液A =Na2HPO4 14. 60g、柠檬酸 9. 33 g、过氧化氢脲0. 52 g，溶于三蒸水，并定容至1 000 mL，调至pH 5. 2 ；底物液B :TMB 20mg、无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装；终止液0. 25% HF溶液；
如图1所示意，本发明的iELISA试剂盒的制备方法为
第二，原核表达系统表达融合蛋白His-dGP5，并经His · Bind Purification Kit
纯化得到融合蛋白浓度为2. 4 mg/mL，应用SDS-PAGE*Wfestern-blotting分析其纯化效果及反应原性；
第二，步骤一的纯化融合蛋白His-dGP5作为包被抗原iELISA的条件优化为iELISA 方法最佳反应条件为抗原包被液浓度1. 0μ g/ΙΟΟμ L ；血清稀释度1:10 ；抗原包被条件 370C Ih再室温12h ；封闭液0. 1%BSA，封闭时间Ih ；酶标二抗稀释浓度1 2000 ；显色反应时间 15min ；
第三，取40份已知PRRS抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行 iELISA反应。样本OD63tl值彡阴性样本OD63tl值的平均值(X)+3 (标准差)=0.观5，可在99% 的水平上判为阳性；因此当样本OD63tl值彡0. 285时，判为阳性；当样本01)630值< 0. 285时， 判为阴性；
第四，基于重组PRRSV GP5蛋白间接ELISA试剂盒的最佳使用步骤与方法确定
①以2.4 mg/100 μ L重组PRRSV GP5蛋白包被ELISA反应板，4 °C作用12h_16h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；②以0. 3mg/100 μ L的BSA溶液封闭ELISA反应板，37°C， 封闭Ihlh后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；③将待检血清用PBST做1 10倍稀释， 按100 μ L加入ELISA反应板，37°C作用Ih后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；④将羊抗猪IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100 μ L加入ELISA反应板，37°C作用Ih后，应用 PBST洗涤ELISA反应板5次；⑤将底物液A和B各50 μ L力口入ELISA反应板，避光室温显色 15min,加入50 μ L终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值。⑥试验结果判定标准为样本OD63tl值(样本OD63tl值>阴性样本OD63tl值的平均值(X)+3标准差(SD)) > 0. 285为阳性，OD63tl值< 0. 285为阴性;
第五，应用步骤三建立的iELISA方法，检测PRRS标准阳性血清的OD63tl值为1. 232 ；猪圆环病毒病标准阳性血清、猪瘟标准阳性血清、猪伪狂犬病标准阳性血清、猪细小病毒病标准阳性血清、猪乙型脑炎准阳性血清的OD63tl值为0. 112 0. M5，确定特异性良好；
第六，应用步骤三建立的iELISA方法，批内及批间重复性试验变异系数为均< 15. 0%，确定该iELISA批内重复性及批间重复性良好；
第七，应用步骤三建立的iELISA方法，检测368份中和试验检测的临床猪血清样本，阳性率为55. 4% (204/368)，确定其临床适用性良好；
第八，步骤五、步骤六和步骤七合格即制得基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒以上第一至第七步骤中按照原料配比进行。
权利要求
1.一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于其组成包括重组蛋白包被5(Γ200 μ L、包被缓冲液25mL-40mL、酶标二抗300-500 μ LUX PBST缓冲液 800mL-1000mL、阳性对照lmL、阴性对照lmL、封闭缓冲液25mL_40mL、底物液A10mL_15mL、底物液 B10mL-15mL 和终止液 10mL_15mL。
2.根据权利要求1所述一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于所述的重组蛋白包被为重组蛋白使用包被缓冲液稀释为1.8 mg/100yL 3 mg/100yL;重组蛋白为PRRSV GP5基因通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达系统获得GP5蛋白，并通过His · Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白；包被缓冲液为=Na2CO3 1.59 g,NaHCO3 2.93 g溶于去离子水中，定容至1000 mL，调至ρ H 9. 5 9. 8。
3.根据权利要求1所述一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为羊抗猪IgG-HRP。
4.根据权利要求1所述一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于所述的 IXPBST 缓冲液为NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0. 2 g、Na2HPO4 · 12H20 2.9 g 禾口 Tween-20 0. 5 mL溶于800 mL蒸溜水，调整pH为7. 2 7. 6，定容至1000 mL。
5.根据权利要求1所述一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为通过PRRS分离毒临床感染猪获得的高免血清，使用时用血清稀释液按 1:10 1:200倍稀释；所述的阴性对照为未感染且未免PRRS疫苗的猪血清，稀释度为 1:10 1:200。
6.根据权利要求1所述一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于所述的封闭缓冲液为BSA0. 3 g (0. 1 0. 5 g)溶于100 mL PBST缓冲液；所述底物液A为 Na2HPO4 14. 60 g、柠檬酸9.33 g和过氧化氢脲0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1000 mL，调至ρ H 5. 0 5. 4 ；所述底物液B为TMB 20mg和无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL, 过滤除菌，无菌分装。
7.根据权利要求1所述一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于所述的终止液为0. 2 % 0. 3% HF溶液。
8.如权利要求1-7任一项所述的一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，其特征在于它包括以下步骤原核表达系统表达融合蛋白His-dGP5，并经His · Bind Purification Kit纯化得到融合蛋白，应用SDS-PAGE和Western-blotting分析其纯化效果及反应原性；第二，步骤一的纯化融合蛋白His-dGP5作为包被抗原，进行抗原包被液浓度、抗原包被条件、封闭液、血清稀释度、封闭时间、酶标二抗稀释浓度和显色反应时间iELISA的条件的优化；第三，取40份已知PRRS抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行 iELISA反应；样本OD63tl值>阴性样本OD63tl值的平均值(X) +3 (标准差)，可在99%的水平上判为阳性，当样本OD63tl值<阴性样本OD63tl值的平均值(X) +3 (标准差)时，判为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒及制备方法，其组成包括重组蛋白包被50~200μL、包被缓冲液25mL-40mL、酶标二抗300-500μL、1×PBST缓冲液800mL-1000mL、阳性对照1mL、阴性对照1mL、封闭缓冲液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL。本发明能监测猪血清PRRSVGP5蛋白抗体，将为PRRS疫苗免疫效果的评价，提供一种更加客观和有效的指标，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，为PRRS的免疫防控提供技术支撑。
文档编号G01N33/569GK102353778SQ201110189010
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者周碧君, 文明, 方英, 王开功, 程振涛, 陈军义 申请人:贵州大学