专利名称：一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测甲病毒的非诊断性方法
技术领域：
本发明涉及一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测甲病毒的非诊断性方法。
背景技术：
披膜病毒科甲病毒属病毒与黄病毒科黄病毒属病毒、呼肠孤病毒科病毒和布尼亚病毒科病毒均属于虫媒病毒，虫媒病毒是指通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病。人、畜一旦被携带病毒的节肢动物叮咬感染，就会带来疾病和死亡，当病毒大面积爆发时，会给爆发地经济带来巨大损失，引起社会恐慌，是各国公共卫生机构都有可能面临的问题。目前，甲病毒主要的鉴定手段是病毒分离，但是由于其对实验条件要求苛刻、操作较复杂、技术难度高并且在检测时间长的同时伴随着严重的生物安全问题，所以无法再实际检测工作中推广使用。近年来使用常规反转录PCR扩增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术在甲病毒的检测方面发挥了重要作用。但目前使用的RT-PCR、 实时荧光PCR大多只是针对某一种虫媒病毒的检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速、敏感的检测和筛选甲病毒属病毒的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测甲病毒的非诊断性方法。为实现上述目的，本发明一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测甲病毒的非诊断性方法，该非诊断性方法包括设计了一对引物和探针对待检样本进行实时定量检测，引物和探针序列如下
权利要求
1. 一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测甲病毒的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括设计了一对引物和探针对待检样本进行实时定量检测，引物和探针序列为正向引物序列Ala-F5，- GCAGGTCACWSMBAATGA -3'反向引物序列Ala-R5'- CATNGGRCARAYRCARTG -3'荧光探针序列Ala-P5'- TXR-CATGCTAATGCYAGAGCGTTTTCGCA-BHQ2-3，
2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述探针连接的荧光基团为 TXR-BHQ2，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是TXR，3’端连接淬灭基团。
3.如权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该淬灭基团为BHQ2非荧光淬灭基团。
4.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述该非诊断性方法包括步骤1)样本用裂解液和RNA抽提液处理，提取病毒RNA；2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系，混勻后短暂离心分装到PCR管中；3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；4)收集荧光信号，检测Ct值。
5.如权利要求4所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下组分体积(μ )2 xRT-PCR Buffer12.5ΙΟμΜ Ala-F0.5ΙΟμΜ Ala-R2ΙΟμΜ Ala-P0.525 xRT-PCR Enzyme Mix1模板RNA5双蒸水3.5总体积25扩增条件采用本领域的标准扩增条件。
全文摘要
本发明公开了一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测甲病毒的非诊断性方法，该非诊断性方法包括一对引物和探针对待检样本进行实时定量检测，利用了PCR对DNA的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量的特点，克服常规PCR检测的不足，具有直观、高度特异性、检测时速度快、步骤简单、重复性好、灵敏度高、可进行多重定量的特点。在实际快速诊断中有极强的操作性。
文档编号G01N21/64GK102559936SQ201210045090
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者刘丽娟, 姚李四, 孙肖红, 杨宇, 燕清丽, 王旺, 郭金金 申请人:中国检验检疫科学研究院