专利名称：一种用于检测抑郁症的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是ー种用于检测抑郁症的试剂盒。
背景技术：
抑郁症是ー种常见的心境障碍，其核心症状为情绪低落、思维迟缓、意志活动减退，还能出现睡眠障碍、反复自杀念头等。据WHO统计，目前全球约有I. 21亿抑郁症患者，每年有850. 000人的死亡与抑郁相关。抑郁症的遗传率约为30% 40%，其中可能涉及到了多个遗传因素。同时，多种非遗传因素(应激、神经发育异常等)増大了抑郁症发病的复杂性，至今抑郁症发病机制仍未明确。临床上通过药物治疗、心理治疗或者物理治疗可使抑郁症状缓解。目前，临床上对抑郁症只能通过临床症状结合抑郁量表来诊断，这种诊断方法难以在疾病潜伏期及其早期阶段明确检测抑郁症，其导致的不良后果是难以在疾病潜伏期及·其早期阶段明确检测抑郁症。因此，现在急需发现ー种新的、具有诊断意义的、能精确定量的抑郁症诊断材料及其使用方法，来对抑郁症进行潜伏期和早期阶段进行诊断，并为患者提供更好的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是为检测抑郁症提供ー种试剂盒，能精确定量地实现对抑郁症患者的诊断。为实现上述目的本发明采用的技术方案是一种用于检测抑郁症的试剂盒，包括一般诊断试剂盒中所使用的成分(即封闭液、酶标抗体、酶底物溶液、終止液、酶标板)和PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白质片段和与PEDF蛋白特异性结合的抗体(以下简称抗PEDF抗体)，其中PEDF蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NOl0上述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。优选单克隆抗体。权利要I所述PEDF蛋白或包含PEDF蛋白的蛋白质片段或与PEDF蛋白特异性结合的抗体在制备检测抑郁症的试剂盒中的应用，其中，正常、精神分裂症、抑郁症及双向情感障碍血清中 PEDF 蛋白的平均值分别为 2918. 9ug/mL、3037. 8ug/mL、1624. 8ug/mL、2838ug/mL0本发明使用蛋白质组学方法分析了在抑郁症中显示特异变化的蛋白质群。通过分析抑郁症患者血浆、精神分裂症、双向情感障碍与正常血浆中的蛋白质数量变化和蛋白质类型发现了下列結果。第一，选择正常血浆作为对照组，通过ニ维凝胶分离和图像分析，在由抑郁症患者的血浆中分离显示性质和数量差异的蛋白质群，使用MALDI-T0F分析仪鉴定蛋白质群，证明了其中观察并鉴定变化的蛋白质是PEDF。第二，在以正常的血液作为正常对照组、以精神分裂症、双向情感障碍的血液作为疾病对照组时，观察到在抑郁血浆中PEDF的表达是降低的，在精神分裂症血浆中表达是增高的。第三，在检查了血液中的靶蛋白变化之后，使用适当的免疫学方法制备了诊断抑郁症的试剂盒，选择了用于测量蛋白质存在值的简单、灵敏、且精确的方法。其中，当患者血浆PEDF浓度低于2485ug/ml时可诊断为抑郁症，可以对抑郁症患者进行诊断。
图I表示将要应用于蛋白质组学分析的血浆的预处理过程；
图2表示血浆在ニ维电泳后银染；A :正常组血浆双向电泳图，B :重性抑郁组血浆双向电泳图，正常血浆的标记区域中显示存在过量的蛋白质，而抑郁症血浆的标记区域中显示蛋白质的数量減少；
图3表示使用MALDI-T0F分析仪得到的图2标记区域中蛋白质经胰蛋白酶处理的肽的质谱，以及肽片段中肽的氨基酸序列，ー级质谱 图4表示图3相应的ニ级质谱图；·· 图5表示图3相应的ニ级质谱 图6表示图3相应的ニ级质谱 图7表示PEDF在正常对照组、精神分裂症组、双向情感障碍组及抑郁症组中PEDF的表达变化；
图8表示PEDF标准溶液和ELISA反应后的光密度測量值。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1，蛋白质组学分析的血浆的预处理。如图I所示，将要应用于蛋白质组学分析的血浆样品与正常血浆对照，然后去除7种高丰度蛋白(Agilent)，Speed Vac对血浆样品进行浓缩，再采用TCA法对浓缩后样品进行除盐、纯化，最后沉淀为干粉备用(在后面的实施例中溶解后再进行的实验)。实施例2，由正常人与抑郁症患者获得的血浆中发生变化的蛋白质群的研究。首先，通过逐步法使用蛋白质的两个不同特征将蛋白质在ニ维上分开。在第一歩中，通过对蛋白质施加点刺激使蛋白质根据蛋白质的静电荷移动(IEF，pH3-10);在第二步中，蛋白质在丙烯酰胺凝胶上根据每种蛋白质的分子量移动。对蛋白进行移位电泳(蛋白质根据PH移动)。然后，在聚丙烯酰胺上对蛋白质进行ニ维电泳(蛋白质根据分子量移动)。用考马斯亮蓝R250染料和银染法将这些移动蛋白质染色用于显影。在电脑中使用图像分析软件TOQuest (Bio-Rad,美国)分析正常血浆与抑郁症血浆之案件的蛋白质差异，本发明人确认了存在现实差异的蛋白质群，參见见图2中方框框出部分。实施例3，正常人与抑郁症患者之间显示差异的血浆蛋白质的鉴定。通过MALDI-T0F分析仪搜索并鉴定具有数量和性质差异的蛋白质(即图2中方框框出部分)以获知蛋白质的种类，见图3-图6，鉴定显示抑郁症患者的PEDF表达低于正常人的血液。实施例4，通过WesternBlotting免疫印迹法检测PEDF表达。如图4，首先制备12名正常、12名精神分裂、12名双向情感障碍及12名抑郁症患者血浆变性样本。在聚丙烯酰胺胶上对蛋白质进行电泳(蛋白质根据分子量移动)，每块凝胶100V。后采用免疫印迹法将SDS-PAGE胶中蛋白转印至PVDF膜上，用抗PEDF抗体对PVDF膜进行免疫反应，4°C过夜。之后取出，TBST洗膜3次，每次10分钟。然后用HRP标记的ニ抗(酶标抗体)与PVDF进行反应，室温下孵育2个小吋。然后采用ECL法对PVDF进行X-胶片曝光，并用Quantity-One软件分析灰度值。比较分析提示，同正常对照组比较，在精神分裂症和双向情感障碍两个疾病对照组中PEDF灰度值大，提示蛋白数量多；而在抑郁症组中PEDF灰度值呈I. 5倍的降低改变，提示蛋白数量少。实施例5，抗体制备。单克隆抗体的方法1)PEDF基因或蛋白免疫动物，2)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；3)杂交瘤细胞的选择培养，筛选和克隆；4)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；5)单克隆抗体的大量制备。多克隆抗体的方法1) PEDF基因或蛋白免疫动物，2)收集免疫动物血清，纯化针对PEDF的多克隆抗体。·实施例6，通过酶联免疫吸收测定法(ELISA)诊断抑郁症。进行本研究是为了查明能否通过酶联免疫吸收测定法(ELISA)使用抗PEDF抗体在正常、精神分裂症及双向情感障碍中鉴别抑郁症患者的血清。在医院中，由50名正常健康人、12名精神分裂症患者、12名双向情感障碍患者和70名抑郁症患者获得血浆。首先准备已包被好的检测PEDF的96孔ELISA试剂盒(Merck Millipore, Billerica,Massachusetts, USA)。由于PEDF在血液中多以结合态存在，预先用8mM尿素处理血衆，室温裂解30min。然后每个孔中加入缓冲液稀释(I: 100)的患者血浆lOOul，37°C反应I小时，然后用Wash buffer清洗6次。向姆个孔中加入IOOul稀释的抗PEDF抗体(MerckMillipore, Billerica, Massachusetts, USA),然后 37°C 反应 I 小时。反应后，将姆个孔用Wash buffer清洗6次。然后，向其中加入IOOul稀释后的过氧化物酶偶联的链霉亲和素，37°C反应I小时。Wash buffer清洗6次。加入IOOul TMB/E底物显影，5_10分钟后加入IOOul终止液终止。酶标仪450nm波长下读数。用PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白质片段制作标准液，进行标准滴定曲线的绘制实验。通过将标准滴定曲线和稀释度转换成光密度来确定每个单位体积(ml)血液中的PEDF数量(见图5)。ELISA測量的结果是，正常对照组血浆中的范围是1897. 6-5409. 4ug/mL，双向情感障碍组血浆中的范围是1676. 1-6160. 5ug/mL，精神分裂症组血浆中的范围是2267. 6-7836. 6ug/mL，抑郁症组血浆中的范围702. 5-2461. 5ug/mL。这些结果在表I中以平均值显示。作为PEDF的测量平均值，正常人是2918. 9ug/mL，双向情感障碍患者是2838ug/mL，精神分裂症患者是3037. 8ug/mL，而抑郁症患者是1624. 8ug/mL。在这里显著显示了抑郁症患者的血浆中存在PEDF減少。依据ROC曲线分析显示了 95. 5%的诊断灵敏性。在精神疾病患者的情况中，PEDF显示了91. 7%诊断特异性(见表I)。其中，当患者血浆PEDF浓度低于2485ug/ml时可诊断为抑郁症。表I:通过ELISA测量健康人和患者血浆中PEDF的平均值
I平均PEDF浓度(ug/ml)
健康人2918. 9±816. 7
双向情感障碍 2838±1219.4 精神分裂症 3730 ±1493.0 重性抑郁 ll624. 8±459. 7本发明涉及用于容易诊断抑郁症的技术。目前尚无用于抑郁症的有效商品，抑郁症完全依靠医院的精神科医生来诊断，对于抑郁症患者而言，不可能在不进行定期心理咨询且没有显著躯体症状的情况下在其早期诊断抑郁症。本发明可通过简单的血液测试，而且能够非常有效的在疾病进展前诊断疾病。具体而言，本发明的有试剂盒花费低廉且处理简单，尤其是对于接受医学测试或咨询医生的抑郁症患者而言，只需调整使用96孔板的ELISA法就能够大量测试。同样，通过使用免疫化学方法，本发明的准确性和精确性好。总之，本发明 有效的在其筛选和早期诊断中诊断抑郁症，而且有助于潜伏期患者来确定药物治疗时间，从而延缓疾病发展。
权利要求
1.一种用于检测抑郁症的试剂盒，包括封闭液、酶标抗体、酶底物溶液、終止液和酶标板，其特征在于还包括PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白质片段，和与PEDF蛋白特异性结合的抗体，其中PEDF蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NOl。
2.根据权利要求I所述ー种用于检测抑郁症的试剂盒，其特征在于所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.权利要I所述PEDF蛋白或包含PEDF蛋白的蛋白质片段或与PEDF蛋白特异性结合的抗体在制备检测抑郁症的试剂盒中的应用，其中，正常、精神分裂症、抑郁症及双向情感障碍血清中 PEDF 蛋白的平均值分别为 2918. 9ug/mL、3037. 8ug/mL、1624. 8ug/mL、2838ug/mL0
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于检测抑郁症的试剂盒，包括封闭液、酶标抗体、酶底物溶液、终止液和酶标板、还包括PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白质片段，和与PEDF蛋白特异性结合的抗体，其中PEDF蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO1。本发明试剂盒可用于早期的抑郁症患者，有助于潜伏期患者来确定药物治疗时间，从而延缓疾病发展，本发明试剂盒的准确性和精确性好。
文档编号G01N33/68GK102788883SQ20121031362
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者周婵娟, 房亮, 杨涌涛, 詹远, 谢鹏 申请人:重庆医科大学