α₁-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型、其制备方法和应用的制作方法

专利名称：α₁-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型、其制备方法和应用的制作方法
α -肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型、其制备方法和应用技术领域
本发明属于新材料领域，尤其涉及a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型、其制备方法和应用。
背景技术：
目前，传统的药物筛选模型主要包括传统动物模型与组织器官水平筛选模型。
传统动物模型是采用整体动物进行药物筛选，通过建立实验动物模型，利用分析化学方法从动物组织中分离活性成分，该模型能直观地反应药物的治疗作用、不良反应及毒性作用。但是，由于这种模型过于依赖实验动物，一方面目前能在实验动物身上复制出来的疾病十分有限，另一方面，生物体内大量内源性物质会对实验产生干扰，因此低效率、高成本等成为了这种模型的弊端。
离体组织器官模型是指，通过组织器官制备成病例模型反映生理状态下药物的作用，观察药物对特定组织或器官的作用，分析药物的作用原理和药理作用。相比整体动物模型，离体组织器官模型具有筛选样品用量小、干扰因素少的特点。但是，仍在存在规模小、效率低等缺点。
高通量筛选模型是在药理、生理、生物化学、分子生物学等多学科交叉的基础上建立并发展起来的。目前，主要的高通量筛选模型大体分为细胞模型、分子模型及其他模型。 细胞模型通过细胞对药物进行筛选，观察被筛样品对细胞的作用，从而筛选有效成分。分子模型主要通过观察药物对靶点的作用，了解药物作用机理，筛选药物活性成分，主要的靶点有酶、受体、基因等。其他模型则包括生化反应中活性物质释放，亚细胞的形态变化等。
与传统动物模型、组织器官模型相比，高通量模型具有用量少、药物作用机制明确、可实现大规模筛选等特点，并已经用于药物高通量筛选。但是由于检测方法和手段的局限，可供药物筛选的检测指标十分有限，该筛选模型的使用也具有一定的局限性，筛选准确性不高，筛选过程复杂。发明内容
有鉴于此，本发明提供一种α r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，解决现有技术中药物筛选准确性不高，过程复杂的问题。
本发明是这样实现的，
一种a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，包括如下步骤
提供含a r肾上腺素受体的溶液，所述a r肾上腺素受体选自α 1Α_肾上腺素受体、ct 1Β-肾上腺素受体或a 1D-肾上腺素受体中的一种；
提供氨丙基硅胶；
将所述氨丙基硅胶加入至含羟基二咪唑的乙腈溶液中，搅拌反应小时，抽滤后收集固体，水洗后向固体中加入磷酸盐缓冲液及所述含a r肾上腺素受体的溶液，于冰水浴条件下反应O. 5 1. O小时，抽滤收集固体，用磷酸盐缓冲液洗涤后加入甘氨酸乙酯，于 15 25°C条件下反应O. 5^1. O小时，得到色谱柱固定相；
将所述色谱柱固定相装于色谱柱中，得到α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型。
本发明还提供一种α r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型，该a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型通过上述a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法制备得到。
本发明还提供上述Q1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型在筛选药物中的应用。
本发明a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，通过将α r肾上腺素受体与氨丙基硅胶键合反应，使a r肾上腺素受体键合到该氨丙基硅胶上，实现所得到的Q1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型中包括该Q1-肾上腺素受体，利用该Ci1-肾上腺素受体与药物的特异性反应，实现药物筛选的高准确性及简便性。本发明 a i-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型中包括该a r肾上腺素受体，利用该α ,-肾上腺素受体与药物的特异性反应，实现药物筛选的准确、简便。本发明实施例色谱柱，通过使用上述a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型，利用α工-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型中a r肾上腺素受体与药物的特异性反应，实现药物筛选的准确、简便。


图I是本发明红花水提液受体色谱图2是本发明红花水提物受体色谱保留成分与羟基红花黄色素A对照品反相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清除明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
a j-肾上腺素受体(a j-adrenergic receptors, a fAR)是七次跨膜G-蛋白偶联受体家族中的一员，广泛分布于血管平滑肌和心肌等组织，主要介导血管平滑肌的收缩，是治疗心脑血管疾病药物发挥药效的主要靶点之一。根据该受体与激动剂和拮抗剂亲和力的不同，a r肾上腺素受体可分为α 1Α、α 1B及α 1D_肾上腺素受体。已有研究结果表明， α 1Α-肾上腺素受体参与血压调控，对维持动脉血压其关键作用；α⑶及a 1D_肾上腺素受体与血管收缩存在一定关系。
生物色谱作为一种新型技术已经应用于药物研发领域，固载化对象多为细胞膜、 血清白蛋白等。前者因相对于固定相孔径而言，细胞膜体积巨大，被吸附于硅胶表面，吸附的均匀程度很难控制，固定相的重现性和稳定性也有待提高。白蛋白属于运输蛋白，自身作为药物靶点的能力较弱。相比之下，固载化的受体亚型稳定性好、对药物选择性高，在药物筛选方面更加具有研究价值。
本发明a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，制备得到含有Q1-肾上腺素受体的Ci1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型，通过该Ci1-肾上腺素受体与待筛选药物的特异性反应，对要需进行准确、简便的筛选。
本发明所称的a r肾上腺素受体均选自α 1Α_肾上腺素受体、α 1β-肾上腺素受体或a 1D-肾上腺素受体中的一种。
本发明实施例提供一种α r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法， 包括如下步骤
步骤SOI，提供含a r肾上腺素受体
提供含a r肾上腺素受体的溶液，所述α r肾上腺素受体选自α 1Α_肾上腺素受体、ct 1Β-肾上腺素受体或a 1D-肾上腺素受体中的一种；
步骤S02，提供氨丙基硅胶；
步骤S03，制备色谱柱固定相
将所述氨丙基硅胶加入至含羟基二咪唑的乙腈溶液中，搅拌反应O. 5^1. O小时， 抽滤并依此用纯乙腈、纯水洗涤后收集固体，水洗后向固体中加入磷酸盐缓冲液及所述含 a r肾上腺素受体的溶液，于冰水浴条件下反应I. (Γ2. O小时，抽滤收集固体，用磷酸盐缓冲液洗涤后加入甘氨酸乙酯，于15 25°c条件下反应O. 5 1. O小时，得到色谱柱固定相；
步骤S04，装柱
将该色谱柱固定相装于色谱柱中，得到得到α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型。
步骤SOl中，该α「肾上腺素受体可以通过自制得到，也可以在市面上购买得到。 本发明中该Ci1-肾上腺素受体通过自制得到，也可以采用本领域中常用的其他方法，具体过程如下
将含a r肾上腺素受体的HEK293细胞贴壁培养30代之内，收集培养后的细胞并保存在缓冲液中。该缓冲液例如磷酸盐溶液、Tris-HCl缓冲液，其pH值为7. (Γ7. 5。该含 a r肾上腺素受体的HEK293细胞选自三种中的一种，一、含α 1Α肾上腺素受体的ΗΕΚ293细胞；二、含α 1Β肾上腺素受体的ΗΕΚ293细胞；三、含a 1D-肾上腺素受体的HEK293细胞。本发明中所使用的含a r肾上腺素受体的HEK293细胞由北京大学第三医院心血管医学研究生张幼仪教授惠赠，为现有公开的菌，具体制备的技术内容请见(I、激动剂作用下α Γ肾上腺素受体亚型在ΗΕΚ293Α细胞中的分布变化2004年8月25日生理学报480-485页张幼怡等；2、a r肾上腺素受体与骨形成蛋白a r片段在人胚肾293细胞中的结合2003年12月 25日生理学报692-698页张幼怡等)。
将上述保存有培养后细胞的磷酸盐缓冲液通过低温高速离心法 (20000. Og · mirT1，30. Omin离心处理，借助离心力收集细胞蛋白，沉降分离沉淀和杂质，然后超声波法提取受体，得到受体粗膜溶液。超声波提取中，所用的细胞裂解液为
10.0Xl(T3mol Llris .HCl, ρΗ7· 4; 50. OX l(T3mol ·L-1NaCl; 5X l(T3moI .L-1EDTAd %TritionX-100(V/V) ; 0. 05%SDS (ff/V) ; 50. 0 X 10_3mol .L1NaF; 100. OX 10_6mol ^L-1Na3VO4; 10.0X 10 3mol *L 1Na4P2O7; 20. Oyg .ml 1 抑妝酶;20. Oyg .ml 1 亮抑酶月太;100. Oyg .ml 1 苯甲基磺酰氟。
将上述受体粗膜溶液用层析柱纯化。该层析柱为2-哌嗪基-4-氨基-6，7- 二甲氧基喹唑啉_Sepharose6B亲和层析柱，纯化中包括第一洗脱液IOOmM NaCl, 10. OmMTris-HCl, 2. OmM EDTA，O. 1% 的脱氧胆酸钠，ρΗ=7· 2 ;第二洗脱液500mM NaCl, 50. OmM EDTA, I. 0%的脱氧胆酸钠，pH=7. 2。纯化步骤为
用第一洗脱液平衡层析柱30分钟，将上述受体粗膜溶液上样，用200ml的第一洗脱液洗脱，第一洗脱液的流速为I. OmL · min-1 ;洗脱至基线平稳后，用200ml的第二洗脱液洗脱，第二洗脱液中加入盐酸特拉唑嗪梯度洗脱，盐酸特拉唑嗪梯度范围为0-80. O μ M。 收集120-150min的洗脱液，用S印hadex G50尺寸排阻柱除去收集液中游离的盐，得到含 Q1-肾上腺素受体的溶液，_70°C冷藏备用。该Ci1-肾上腺素受体的溶液的质量浓度为O.75 3 μ g · μ Γ1。
步骤S02中，本发明实施例中所使用的氨丙基硅胶通过自制得到，制备方法如下
将活化处理后的硅胶加入至甲苯中，无氧条件下加热回流至甲苯沸腾，加入 Y-氨丙基三乙氧基硅烷，反应1(Γ12小时，得到氨丙基硅胶；
该硅胶的活化过程如下
将硅胶加入至盐酸溶液中，加热回流反应:Γ5小时，抽滤、水洗后于10(T12(TC条件下干燥，得到活化处理后的硅胶。
其中，该硅胶与盐酸的质量体积比为1 2:2(Γ80，单位是g/ml，例如，将2g的硅胶加入60ml的盐酸中，盐酸溶液的质量浓度没有限制。将硅胶加入至盐酸中然后将加热至微沸,反应3飞小时，反应完成后将反应后产物抽滤(O. 45 μ m水系膜)，收集固体物,用水反复洗涤至固体的PH值呈中性，然后在10(Tl2(rC条件下干燥过夜，即得活化处理后的硅胶。
将活化处理后的硅胶放入反应器中，加入IOOml甲苯，该甲苯优选为通过Na干燥后的甲苯，然后向反应器通过惰性气体，例如氮气、氩气、氦气等，加热回流至甲苯沸腾，温度为110°C，再向反应器中加入Y-氨丙基三乙氧基硅烷，该硅胶与Y-氨丙基三乙氧基硅烷的重量体积比为1^^:2 41111，例如，用28的硅胶反应，加入31111的Y-氨丙基三乙氧基硅烷；加入Y _氨丙基三乙氧基硅烷后继续回流反应O. 5^1. O小时，反应结束后将反应后产物抽滤，收集固体，待该固体中有机试剂挥干，放入干燥器干燥，得到氨丙基硅胶。
步骤S03中，步骤S02得到的氨丙基硅胶加入至含羟基二咪唑的乙腈溶液中，该氨丙基硅胶与该羟基二咪唑的重量比为广3: f 2，该氨丙基硅胶和该乙腈溶液的重量体积比为I 2:20 80，单位是g/ml，例如，将2g的氨丙基硅胶加入至50. OmL含I. Og羰基二咪唑的乙腈溶液中；然后在常温下搅拌反应O. 5 1. O小时，将反应后产物抽滤，收集固体，用水反复洗涤将固体中的乙腈清除干净。然后向洗涤后的固体中加入磷酸盐缓冲液，以及步骤SOl中得到的含α r肾上腺素受体的溶液，该氨丙基硅胶和该a r肾上腺素受体的重量体积比为广2:3 15，单位是g/ml，例如，2g的氨丙基硅胶所用的含Ci1-肾上腺素受体的溶液的体积为5ml。然后将温度调整至冰水浴反应I. (Γ2. O小时，反应后抽滤收集固体，用磷酸缓冲液洗涤收集的固体，将未键合的蛋白质除去，然后向固体中加入甘氨酸乙酯，于15. (Γ20. (TC条件下反应O. 5^1. O小时，该氨丙基硅胶和该甘氨酸乙酯的重量比为 3 10:广2，该甘氨酸乙酯的质量浓度为O. 259Tl%。通过加入甘氨酸乙酯，封闭硅胶表面未和受体结合的硅羟基，防止后期因为硅羟基的作用带来非特异性吸附的假阳性结果。反应完成后抽滤，收集固体，用PBS洗涤除去未反应的甘氨酸乙酯，得到色谱柱固定相，将该色谱柱固定相于4 °C保存备用。
步骤S04中，该α r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型装柱方法，没有限制，例如
色谱固定相，采用湿法装柱，以5. OmM Tris-HCl溶液(pH7. 2)为匀浆液和顶替剂， 在400bar的压力下装填色谱柱(50 X 2. Imm, 7. O μ M)；
色谱柱特异性检测
色谱条件为:流动相，10.OmM Tris-HClU. OmM EDTAU. OmM NaCl(ρΗ7. 2);检测波， 254nm、280nm，流速，O. 5mL/min ;柱温，20°C。分别测定盐酸特拉唑嗪、去甲肾上腺素、坦索罗辛、间羟胺、乌拉地尔的保留时间，用亚硝酸钠测定系统死时间。上述阳性工具药中盐酸特拉唑嗪、坦索罗辛为选择性α 1Α-肾上腺素受体拮抗剂；乌拉地尔为α 1Α-肾上腺素受体激动剂；酚妥拉明、间羟胺可直接激动α -肾上腺素受体；去甲肾上腺素主要激动α -肾上腺素受体。结果表明上述工具药在α1Α-肾上腺素受体生物色谱柱上容量因子均大于I，且在数值上存在明显差异。阳性工具药在Q1-肾上腺素生物色谱柱上的保留主要由受体-配体的特异亲和作用产生，同时结合非特异性研究排除了硅胶的非特异吸附作用。因此，得出结论色谱固定相对上述阳性工具药产生结合作用，并且对于不同药物结合能力有所差异， a r肾上腺素受体生物色谱柱具备特异性识别并结合其阳性药物的能力。
本发明实施例a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，通过将 ar肾上腺素受体与氨丙基硅胶反应，使a r肾上腺素受体键合到氨丙基硅胶上，通过 a r肾上腺素受体与待筛选药物之间的特异性反应，实现对药物准确、简便的筛选。
本发明实施例进一步提供一种α r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型，该 ar肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型通过上述a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法制备得到。本发明ar肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型中包括该CI1-肾上腺素受体，利用该CI1-肾上腺素受体与药物的特异性反应，实现药物筛选的准确、简便。
本发明实施例进一步提供上述a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型在筛选药物中的应用。
以下通过具体实施例对上述色谱柱制备方法进行详细阐述。
实施例一
本发明实施例色谱柱制备方法，包括如下步骤
I、制备含α 1Α肾上腺素受体的溶液
贴壁培养膜上高表达α1Α-亚型肾上腺素受体ΗΕΚ293细胞系(上述细胞由北京大学第三医院血管医学研究所张幼怡教授惠赠)，收集细胞保存在磷酸盐缓冲液中，依次通过低温高速离心方法(20000. Og · min—1，30. Omin)、超声波提取(裂解液10. OXlO^mol^r1Tris *HCl,pH7. 4;50. 0X10_3mol · T1NaCl; 5 X 10_3mol · L-1EDTA; l%TritionX-100 (V/ V) ;0. 05%SDS (ff/V) ;50. OX l(T3mol .L-1NaF; 100. 0 X l(T6mol ^L-1Na3VO4; 10. OX l(T3mol 'L-1Na4 P2O7; 20. Oyg ι Γ1抑肽酶；20. 0 μ g πιΓ1亮抑酶肽；100. Oyg πιΓ1苯甲基磺酰氟)对细胞进行处理，获得受体粗膜溶液；
2、α 1Α-肾上腺素受体亚型的纯化
采用亲和层析法纯化受体粗膜溶液，以2-哌嗪基-4-氨基-6，7- 二甲氧基喹唑啉-Sepharose6B 亲和层析柱为层析柱，洗脱液 A (IOOmM NaCl, 10. OmM Tris-HCl, 2. OmM EDTA，0. 1%的脱氧胆酸钠，pH=7. 2)平衡层析柱30min后，将受体粗膜溶液上样，用200mLA液洗脱，流速 I. OmL .min-Ι。待基线平稳后，换 200mLB 液(500mM NaCl, 50. OmM EDTA, I. 0% 的脱氧胆酸钠，pH=7. 2)洗脱，洗脱液B中加入盐酸特拉唑嗪梯度洗脱，盐酸特拉唑嗪梯度范围为0-80. 0μ M (O. 5yM/min依此递增)。收集120_150min的洗脱液，用S印hadex G50 尺寸排阻柱除去收集液中游离的盐，_70°C冷藏，该Ciia-肾上腺素受体的溶液的质量浓度为 O. 75 μ g · μ Γ1 ；
3、α 1Α-肾上腺素受体亚型生物色谱模型的建立
称取2g硅胶，加入60. OmL HC1，加热回流4h (微沸)，停止反应后，冷却至室温，抽滤(O. 45 μ m水系膜)，用水洗至pH为中性，110°C烘箱干燥过夜。将活化好硅胶放入250ml 三颈瓶，加入Na干燥的甲苯IOOmL,通氮气加热回流,至甲苯沸腾,加入3mL Y -氨丙基三乙氧基硅烷，反应过夜，停止反应，抽滤，待有机试剂挥干，放入干燥器备用；
取2g干燥氨丙基硅胶，溶于50. OmLl. Og羰基二咪唑的乙腈溶液，置于反应器中，室温下搅拌，反应l.Oh ;停止反应后，抽滤，水洗除去乙腈；硅胶中加入磷酸盐缓冲液 (pH7. 2)及纯化后的受体溶液10. 0mL，4°C搅拌反应2. Oh ;抽滤，磷酸盐缓冲液(pH7. 2)洗去未键和蛋白质；加入I. 0%甘氨酸乙酯溶液50. 0mL，4°C搅拌反应30. Omin ;抽滤，PBS洗去残留的甘氨酸乙酯，4°C保存备，得到α 1Α-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型；
实施例二
本发明实施例色谱柱制备方法，包括如下步骤
I、制备含α 1Β-肾上腺素受体的溶液
贴壁培养膜上高表达α1Β-亚型肾上腺素受体ΗΕΚ293细胞系(上述细胞由北京大学第三医院血管医学研究所张幼怡教授惠赠)，收集细胞保存在磷酸盐缓冲液中，依次通过低温高速离心方法(20000. Og · min—1，30. Omin)、超声波提取(裂解液10. OXlO^m ol ^r1Tris *HCl,pH7. 4;50. 0X10_3mol · T1NaCl; 5 X 10_3mol · L-1EDTA; l%TritionX-100 (V/ V) ;0. 05%SDS (ff/V) ;50. OX l(T3mol .L-1NaF; 100. 0 X l(T6mol ^L-1Na3VO4; 10. OX l(T3mol 'L-1Na4 P2O7; 20. Oyg ι Γ1抑肽酶；20. 0 μ g πιΓ1亮抑酶肽；100. Oyg πιΓ1苯甲基磺酰氟)对细胞进行处理，获得受体粗膜溶液；
2、α 1Β_肾上腺素受体亚型的纯化
采用亲和层析法纯化受体粗膜溶液，以2-哌嗪基-4-氨基-6，7- 二甲氧基喹唑啉-Sepharose6B 亲和层析柱为层析柱，洗脱液 A (IOOmM NaCl, 10. OmM Tris-HCl, 2. OmM EDTA，0. 1%的脱氧胆酸钠，pH=7. 2)平衡层析柱30min后，将受体粗膜溶液上样，用200mLA 液洗脱，流速 I. OmL .min-Ι。待基线平稳后，换 200mLB 液(500mM NaCl, 50. OmM EDTA, I. 0% 的脱氧胆酸钠，pH=7. 2)洗脱，洗脱液B中加入盐酸特拉唑嗪梯度洗脱，盐酸特拉唑嗪梯度范围为0-80. Ομ M (O. 5μΜ/π η依此递增)。收集120_150min的洗脱液，用S印hadex G50尺寸排阻柱除去收集液中游离的盐，该Ciib-肾上腺素受体的溶液的质量浓度为I.8μ g · μ Γ1, -70°C冷藏；
3、α 1Β-肾上腺素受体亚型生物色谱模型的建立
称取Ig硅胶，加入20. OmL HC1，加热回流3h (微沸)，停止反应后，冷却至室温，抽滤(O. 45 μ m水系膜)，用水洗至pH为中性，110°C烘箱干燥过夜。将活化好硅胶放入250ml 三颈瓶，加入Na干燥的甲苯IOOmL,通氮气加热回流,至甲苯沸腾,加入2mL Y -氨丙基三乙氧基硅烷，反应过夜，停止反应，抽滤，待有机试剂挥干，放入干燥器备用；
取Ig干燥氨丙基硅胶，溶于20. OmL含I. Og羰基二咪唑的乙腈溶液，置于反应器中，室温下搅拌，反应O. 5h;停止反应后，抽滤，水洗除去乙腈；硅胶中加入磷酸盐缓冲液 (pH7. 2)及纯化后的受体溶液3. 0mL，4°C搅拌反应I. Oh ;抽滤，磷酸盐缓冲液(pH7. 2)洗去未键和蛋白质；加入重量份数为I. 0%的甘氨酸乙酯溶液50. 0mL，4°C搅拌反应30. Omin ;抽滤，PBS洗去残留的甘氨酸乙酯，4°C保存备，得到α i-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型。
实施例三
本发明实施例色谱柱制备方法，包括如下步骤
I、制备含a 1D肾上腺素受体的溶液
贴壁培养膜上高表达α 1D亚型肾上腺素受体ΗΕΚ293细胞系(上述细胞由北京大学第三医院血管医学研究所张幼怡教授惠赠)，收集细胞保存在磷酸盐缓冲液中，依次通过低温高速离心方法(20000. Og .mirT1, 30. Omin)、超声波提取(裂解液10. OX l(T3mol .L-1Tris · HCl, ρΗ7· 4; 50. O X l(T3mol .L-1NaCl; 5 X l(T3mol .L-1EDTA; l%TritionX-100 (V/V) ; 0. 05%SDS (ff/V );50. OX l(T3mol .L-1NaF; 100. O X l(T6mol ^L-1Na3VO4; 10. OX l(T3mol '[1Na4P2O7; 20. Oyg πιΓ1 抑肽酶；20. O μ g · πιΓ1亮抑酶肽；100. O μ g · πιΓ1苯甲基磺酰氟)对细胞进行处理，获得受体粗膜溶液；
2、a 1D-肾上腺素受体亚型的纯化
采用亲和层析法纯化受体粗膜溶液，以2-哌嗪基-4-氨基-6，7- 二甲氧基喹唑啉-Sepharose6B 亲和层析柱为层析柱，洗脱液 A (IOOmM NaCl, 10. OmM Tris-HCl, 2. OmM EDTA，0. 1%的脱氧胆酸钠，pH=7. 2)平衡层析柱30min后，将受体粗膜溶液上样，用200mLA 液洗脱，流速 I. OmL .min-Ι。待基线平稳后，换 200mLB 液(500mM NaCl, 50. OmM EDTA, I. 0% 的脱氧胆酸钠，pH=7. 2)洗脱，洗脱液B中加入盐酸特拉唑嗪梯度洗脱，盐酸特拉唑嗪梯度范围为0-80. ΟμΜ (O. 5yM/min依此递增)。收集120_150min的洗脱液，用S印hadex G50 尺寸排阻柱除去收集液中游离的盐，_70°C冷藏；
3、a 1D-肾上腺素受体亚型生物色谱模型的建立
称取I. 5g硅胶，加入80. OmL HC1，加热回流4h (微沸)，停止反应后，冷却至室温， 抽滤(O. 45 μ m水系膜)，用水洗至pH为中性，110°C烘箱干燥过夜。将活化好硅胶放入250ml 三颈瓶，加入Na干燥的甲苯IOOmL,通氮气加热回流,至甲苯沸腾,加入3mL Y -氨丙基三乙氧基硅烷，反应过夜，停止反应，抽滤，待有机试剂挥干，放入干燥器备用；
取I. 5g干燥氨丙基硅胶，溶于80. 0mL2. Og羰基二咪唑的乙腈溶液，置于反应器中，室温下搅拌，反应2. Oh;停止反应后，抽滤，水洗除去乙腈；硅胶中加入磷酸盐缓冲液 (pH7. 2)及纯化后的受体溶液15. 0mL，4°C搅拌反应2. Oh ;抽滤，磷酸盐缓冲液(pH7. 2)洗去未键和蛋白质；加入I. 0%甘氨酸乙酯溶液50. 0mL，4°C搅拌反应30. Omin ;抽滤，PBS洗去残留的甘氨酸乙酯，4°C保存备，得到α 1D-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型。
应用例I
甲基原薯蓣皂苷的筛选
I、甲基原薯蓣皂苷对照品溶液制备
称取O. Olg甲基原薯蓣皂苷对照品、去离子水，加入至25. OmL容器中，加水至刻度，制备成浓度为O. 40mg/mL的对照品溶液，4°C冷藏备用；
2、甲基原薯蓣皂苷的亚型受体色谱分析
肾上腺素受体亚型生物色谱条件
分别采用实施例一、实施例二、实施例三制备的三种a i-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型；流动相10· OmM Tris-HClU. OmM EDTAU. OmMNaCl (pH7. 2);检测波长 403nm ;流速0. 5mL/min ;柱温，20 °C ;进样量20μ L ；
3、肾上腺素受体亚型生物色谱分析结果
在拟定色谱条件下，分别采用3中色谱对待测样品进行分析，结果表明甲基原薯蓣皂苷在α 1Α、α 1Β及a 1D-AR生物色谱柱上的保留时间分别为5. 2、3. 8、3. 7min ;容量因子 K值分别为2. 3、I. 4、I. 3 (系统死时间tQ=l. 6min)。上述结果表明，甲基原薯蓣皂苷与三种受体亚型色谱柱产生了受体-配体的特异亲和作用，而上述数据的差异性表明了三种受体亚型色谱选择性吸附的差异性。
应用例2
筛选中药材红花中的活性成分
I、样品制备
( I)红花水提物的制备
取干燥恒重红花药材20. Og,粉碎过40目筛，干燥至恒重，称量5. Og,置于反应器中，加入10倍量纯水，超声提取3次，每次30min (功率100w，频率40kHz)，过滤，合并滤液， 减压浓缩至50. OmL ；
( 2)对照品溶液的制备
称取O. OlOg红花黄色素A对照品、甲醇，溶解于25. OmL容器中，加甲醇至刻度，制备成浓度为O. 40mg/mL的对照品溶液，4°C冷藏备用；
2、红花活性成分的筛选及分析
肾上腺素受体亚型生物色谱条件
分别采用实施例一、实施例二、实施例三制备的三种色谱柱固定相；流动相 10. OmM Tris-HClU. OmM EDTAU. OmM NaCl (ρΗ7· 2);检测波长 403nm ;流速0. 5mL/min ;柱温，20°C ;进样量20yL ;
液质联用分析条件
反相色谱柱(AgilentSB-C18, 2. I X 150mm, 5 μ m),流速:0· 8mL/min ；流动相甲醇0. 2%甲酸水=35 65 ;柱温:30°C;检测波长:254、280、430nm。电喷雾负离子模式(ESI-) 电离，雾化气压力为40. Opsi，干燥气流速为10. OmL/min，干燥气温度为400°C，毛细管电压为-4200V，扫描范围为50 1500amu。
3、筛选方法
在上述色谱、质谱条件下，将制备得红花水提液进行肾上腺素受体亚型生物色谱筛选(进样量为20μ L)收集红花水提液色谱中保留时间为8. 2min的组分，氮气吹干，甲醇水溶样后进行HPLC-MS分析。
4、筛选结果
对结果进行分析，发现红花水提液在α 1Α-肾上腺素受体生物色谱柱上有一保留成分，如图I所示；对该保留成分进行反相液相色谱分析，结果表明其在反相色谱上的保留性质与羟基红花黄色素一致，如图2所示，进而对该保留成分进行ESI/MS分析，在负离子模式下得到[M-l] m/z611. 6，以其作为母离子裂解脱去120Da中性成分得到基峰碎片离子峰 m/z491 (611-120)，M2谱脱去一分子水得到m/z473。上述结果与羟基红花黄色素A对照品质谱裂解表现一致，判断筛选获得的活性成分为羟基红花黄色素A。该结果提示我们，羟基红花黄色素A很有可能为红花扩张血管的活性成分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，包括如下步骤 提供含a r肾上腺素受体的溶液，所述Ct1-肾上腺素受体选自α 1A-肾上腺素受体、α IB-肾上腺素受体或α id-肾上腺素受体中的一种； 提供氣丙基娃月父; 将所述氨丙基硅胶加入至含羟基二咪唑的乙腈溶液中，搅拌反应O. 5^1. O小时，抽滤收集固体，水洗后向固体中加入磷酸盐缓冲液及所述含Q1-肾上腺素受体的溶液，于冰水浴下反应I. (Γ2. O小时，抽滤收集固体，用磷酸盐缓冲液洗涤后加入甘氨酸乙酯，于15. (Γ25. O下反应O. 5^1. O小时，得到色谱柱固定相； 将所述色谱柱固定相装于色谱柱中，得到a r肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型。
2.如权利要求I所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，其特征在于，所述氨丙基硅胶与所述羟基二咪唑的重量比为广3 :广2。
3.如权利要求I所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，其特征在于，所述氨丙基硅胶与所述a r肾上腺素受体的重量体积比为广2 :3 15。
4.如权利要求I所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，其特征在于，所述氨丙基硅胶与所述甘氨酸乙酯的重量比为TlO: f 2。
5.如权利要求I所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，其特征碍于，所述氨丙基硅胶的过程如下 将活化处理后的硅胶加入至甲苯中，无氧条件下加热回流至甲苯沸腾，加入Y-氨丙基三乙氧基硅烷，反应1(Γ12小时，得到氨丙基硅胶。
6.如权利要求5所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，其特征在于，所述硅胶的活化处理过程为 将硅胶加入至盐酸溶液中，加热回流反应3飞小时，抽滤、水洗后于10(T12(TC条件下干燥，得到活化处理后的硅胶。
7.如权利要求5所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，其特征在于，所述硅胶与Y-氨丙基三乙氧基硅烷的重量体积比为广3:2 4。
8.一种Ci1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型，其特征在于，由权利要求f 8任一项所述的α「肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法制备得到。
9.如权利要求8所述的色谱柱在药物筛选中的应用。
全文摘要
本发明适用于新材料领域，提供了α1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型、其制备方法和应用。本发明α1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型制备方法，包括提供含α1-肾上腺素受体的溶液、提供氨丙基硅胶、制备色谱柱固定相等步骤，通过将α1-肾上腺素受体与氨丙基硅胶键合反应，实现所得到的α1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型中包括该α1-肾上腺素受体，利用该α1-肾上腺素受体与药物的特异性反应，实现药物筛选的高准确性及简便性。本发明α1-肾上腺素受体亚型生物色谱筛选药物模型中包括该α1-肾上腺素受体，利用该α1-肾上腺素受体与药物的特异性反应，实现药物筛选的准确、简便。
文档编号G01N30/89GK102928535SQ201210423978
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者郑晓晖, 王雪艳, 裴渭静, 唐旭东, 孟雪 申请人:深圳清华大学研究院, 西北大学, 深圳中药及天然药物研究中心