专利名称：一种小麦组织胼胝质的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物组织显微制片和组织成分的化学定位技术领域，具体的说是一种小麦组织胼胝质的快速检测方法。
背景技术：
胼胝质是一种以β_1，3-键结合的葡聚糖，在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用，其合成与分解直接关系植物正常的生长代谢过程。此夕卜，当植物受到外界不良环境胁迫或强烈刺激，如病原菌侵染、营养胁迫、机械损伤、高温等逆境时，胼胝质代谢会立即反馈并调节植物细胞的生理活动(Wang, McCallum, Fetch等，2012 ;Chapman等,2009 ;Saulnier等,2012)。逆境下,筛管分子内会迅速合成胼胝质并沉积到筛板的表面或筛孔内堵塞；一旦外界刺激解除，沉积到筛板表面或筛孔内的胼胝质则会迅速消失，使筛管恢复正常的运输功能。因此，胼胝质的沉积与消解与植物的抗性有关，抗性强的植物胼胝质形成的少且迟缓(Cheng等，2012)。总之，胼胝质代谢是植物领域重要的研究内容之一。小麦是两年生作物，在整个生活史中要遭受一系列自然逆境与生物逆境。在逆境中，小麦组织，特别是微管束中，诱导合成胼胝质，影响植物对水分、养分的吸收与运输。逆境下，灌浆期小麦由于胼胝质堵塞胞间连丝、筛管等而影响植株贮藏物质的向籽粒中运输，严重影响灌浆速率，最终导致产量下降。因此，监测逆境中小麦微管束组织中胼胝质合成及含量是衡量小麦高产稳产的一个关键指标，是育种学家筛选优良小麦品种的一个重要依据。目前，对于胼胝质消长过程控制机制仍不明确，加强研究是必要的，其中快速制片及胼胝质精准标记定位是关键。常规植物组织显微观察制片一般是制备石蜡切片或冷冻切片。然而，制备石蜡切片，材料前处理程序繁琐，周期长，其过程包括FAA固定、脱水、浸蜡、二甲苯脱蜡等一系列步骤，并且操作中易产生挥发性有毒气体，对人员造成伤害与环境污染。更重要的是，因其周期长而延误对生长中的植物生长状况作出快速鉴定与补救措施。冷冻切片技术，虽然在动物材料(因其细胞没有细胞壁)切片制作上比较成熟，而在植物组织上其技术难以掌握，并且仪器价格昂贵、耗材造价高，更为严重的是，因材料难以固定在底座上，当切小麦、水稻等表皮硅质层较厚的材料时易造成颤刀，影响制片效果。因此，针对生长中的植物组织进行快速制片、快速标记、快速检测是判断植物生长状况并提出应急补救措施的关键。苯胺蓝对胼胝质会产生专一性反应，在紫外光激发下能诱发出黄绿色荧光，因而可用来检测胼胝质沉积部位与相对含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小麦组织胼胝质的快速检测方法。本发明对小麦叶片组织、茎杆组织进行徒手切片法制片，并应用水溶性苯胺蓝在碱性条件下对组织中沉积的胼胝质进行精准标记、精准定位以及其相对含量的比较，最大限度降低了操作过程中产生的误差。本发明所采用的技术方案为:一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，其特征是，包括以下步骤:(I)溶液的配制:固定液的配制:将乙醇与三氯甲烷按3:1 (v/v)混合后作为混合溶剂，以上述混合溶剂为溶剂配制体积分数为0.15%的三氯乙酸溶液；染色负载缓冲液的配制:配制pH=8.5 9.5的50 150mmol/L的K2HPO4缓冲液或Tris-HCl缓冲液；然后将0.0lg水溶性苯胺蓝溶解于IOOml上述缓冲液中即为染色负载液；(2)材料处理:取小麦茎、叶等组织，蒸馏水清洗干净，若立刻进入实验室操作，则用吸水纸吸干；若不能即刻进入实验操作，则将材料切成3 5mm长的组织块，用固定液固定，染色时将材料取出，依次用50%乙醇、蒸馏水洗净，然后用吸水纸吸干；(3)徒手切片制作:用锋利刀片，将小麦茎、叶等组织切割成厚度为20 40μπι切片，置于载玻片上；(4)材料染色:用移液枪(管)吸取100 150 μ L的样品染色负载缓冲液滴到置于载玻片的切片上，然后将载玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽气5min，随后在25°C条件下避光放置5 lOmin，用移液枪吸掉样品上的染色负载缓冲液，之后用移液枪吸取蒸馏水漂洗染色后的切片；(5)将100 μ L50%甘油滴在材料表面，然后用盖玻片封片；(6)显微镜观察拍照:将经过上述步骤处理的切片放置在落射荧光显微镜上，用激光激发装置激发，在显微镜下观察，并用CCD图像采集系统拍照。优选的，所述的锋利刀片为剃须刀片或手术刀片。优选的，所述的激发装置激发波长为400 485nm,发射波长为490 560nm。本发明所具有的优点:(I)传统的石蜡切片对胼胝质的定位标记耗时较长(2 3周)、冷冻切片法所需设备条件较高。本发明中植物组织制片采用徒手切片方法，该法简便，易于掌握，快速省时；如果实验室取材或室外取材能在30分钟内进入实验操作，材料无需固定即可染色。避免了其他方法中样品长时间处理、染色期间胼胝质含量及部位的失真。更重要的是，快速检测结果能够对生长中的小麦生长状况作出快速判断并制定补救措施。(2)采用偏碱性缓冲液配置染色负载液，消除了水溶性苯胺蓝自身颜色对切片观察的干扰，保证定位准确，相对含量差异明显。(3)经上述处理并染色后的材料，如不及时观察可转入酒精置冰箱或用甘油封片，置冰箱可保存数周，对染色后的胼胝质无显著影响。(4)该方法可操作性强，实验中所用的染料以及其他试剂对胼胝质荧光观察无干扰。
图1为实施例1中灌浆期小麦叶片组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果。
图2为实施例2中灌浆期小麦茎组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果。图3为实施例3中固定液固定后适量施氮条件下的开花期小麦茎组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果。图4为实施例3中固定液固定后低施氮量条件下的开花期小麦茎组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果。
具体实施例方式为阐明对本发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。实施例1一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，在小麦品种济麦22叶片组织中的应用，具体操作如下:配制溶液:染色负载缓冲液的配制:配制lOOmmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.8);然后将0.0lg水溶性苯胺蓝溶解于IOOml上述缓冲液中即为染色负载缓冲液。材料处理:取灌浆中期小麦叶片组织，随即带回实验室，用吸水纸吸干。徒手切片制作:用锋利刀片(手术刀片)，将小麦叶片组织切割成厚度为20 40 μ m切片，置于载玻片上；材料染色:用移液枪或移液管吸取100 150 μ L的样品染色负载缓冲液滴到置于载玻片的切片上，然后将载玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽气5 8min,以抽去材料表面的气泡，促使负载缓冲液快速进入材料内部，同时去除气泡也可以提高观察效果；随后在25°C条件下避光放置5 IOmin，用移液枪吸掉样品上的染色负载缓冲液，之后用移液枪吸取蒸馏水漂洗染色后的切片；将100 μ L50%甘油滴在切片表面，然后用盖玻片封片；显微镜观察拍照:将经过上述步骤处理的切片放置在落射荧光显微镜上，用激光激发装置激发，激发波长为400 485nm，发射波长为490 560nm，在显微镜下观察，并用CXD图像采集系统拍照。结果如附图1所示，维管束导管壁、表皮组织、厚壁组织细胞壁上含有较高含量的胼胝质(图中箭头所指为胼胝质产生部位与相对含量，高亮度部位说明胼胝质含量高，低亮度部位说明胼胝质含量相对较低)(标尺=200 μ m)。实施例2一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，在小麦品种济麦22茎组织中的应用，具体操作如下:配制溶液:染色负载缓冲液的配制:配制150mmol/L的K2HP04缓冲液(pH=9.5);然后将
0.0lg水溶性苯胺蓝溶解于IOOml上述缓冲液中即为染色负载缓冲液；材料处理:取灌浆中期小麦茎组织，随即带回实验室，用吸水纸吸干。徒手切片制作:用锋利刀片(手术刀片)，将小麦叶片组织切割成厚度为20 40 μ m切片，置于载玻片上；
材料染色:用移液枪或移液管吸取100 150 μ L的样品染色负载缓冲液滴到置于载玻片的切片上，然后将载玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽气5 8min,以抽去材料表面的气泡，促使负载缓冲液快速进入材料内部，同时去除气泡也可以提高观察效果；随后在25°C条件下避光放置5 IOmin，用移液枪吸掉样品上的染色负载缓冲液，之后用移液枪吸取蒸馏水漂洗染色后的切片；将100 μ L50%甘油滴在切片表面，然后用盖玻片封片；显微镜观察拍照:将经过上述步骤处理的切片放置在落射荧光显微镜上，用激光激发装置激发，激发波长为400 485nm，发射波长为490 560nm，在显微镜下观察，并用CXD图像采集系统拍照。结果如附图2所示，胼胝质主要在维管束木质部与韧皮部细胞壁中合成，在厚壁细胞中有微量胼胝质合成(图中箭头所指为胼胝质产生部位)(标尺=200 μ m)。实施例3一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，在固定液固定24小时、保护性耕作条件下(上季作物玉米收获后其秸杆直接粉碎还田，小麦用免耕机播种)、不同施氮量下开花期济麦22茎组织中的应用，具体操作如下:配制溶液:固定液的配制:将乙醇与三氯甲烷按3:1 (v/v)混合后作为混合溶剂，以上述混合溶剂为溶剂配制体积分数为0.15%的三氯乙酸溶液；染色负载缓冲液的配制:配制67mmol/L的K2HPO4缓冲液(pH=9.0);然后将0.0lg水溶性苯胺蓝溶解于IOOml上述缓冲液中即为染色负载缓冲液；材料处理:取灌浆中期小麦茎组织，随即带回实验室，用吸水纸吸干。徒手切片制作:用锋利刀片(手术刀片)，将小麦叶片组织切割成厚度为20 40 μ m切片，置于载玻片上；材料染色:用移液枪或者移液管吸取100 150 μ L的样品染色负载缓冲液滴到置于载玻片的切片上，然后将载玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽气5 8min，以抽去材料表面的气泡，促使负载缓冲液快速进入材料内部，同时去除气泡也可以提高观察效果；随后在25°C条件下避光放置5 lOmin，用移液枪吸掉样品上的染色负载缓冲液，之后用移液枪吸取蒸馏水漂洗染色后的切片；将100 μ L50%甘油滴在切片表面，然后用盖玻片封片；显微镜观察拍照:将经过上述步骤处理的切片放置在落射荧光显微镜上，用激光激发装置激发，激发波长为400 485nm，发射波长为490 560nm，在显微镜下观察，并用CXD图像采集系统拍照。结果如附图3和附图4所示，胼胝质主要在维管束木质部与韧皮部细胞壁中合成，在厚壁细胞中有微量胼胝质合成(图中箭头所指为胼胝质产生部位)，同时，荧光标记显示，如图3所示，适量氮条件下，胼胝质含量较低，如图4所示，低施氮量下小麦茎维管束中胼胝质沉积较多(标尺=200 μ m)。上面虽结合实施例对本发明作了详细的说明，但是，所述技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，在权利要求保护的范围内，还可以对上述实施例进行改变。
权利要求
1.一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，其特征是，包括以下步骤: (1)溶液的配制: 固定液的配制:将乙醇与三氯甲烷按体积比为3:1混合后作为混合溶剂，以上述混合溶剂为溶剂配制体积分数为0.15%的三氯乙酸溶液； 染色负载缓冲液的配制:配制pH=8.5 9.5的50 150mmol/L的K2HPO4缓冲液或Tris-HCl缓冲液；然后将0.0lg水溶性苯胺蓝溶解于IOOml上述缓冲液中，即为染色负载缓冲液； (2)材料处理:取小麦茎组织或叶组织，蒸馏水清洗干净， 若立刻进入实验室操作，则用吸水纸吸干； 若不能即刻进入实验操作，则将小麦茎组织或叶组织切成3 5mm长的组织块，用固定液固定，染色时将材料取出，依次用50%乙醇、蒸馏水洗净，然后用吸水纸吸干； (3)徒手切片制作:用锋利刀片，将经过步骤(2)处理的小麦茎组织或叶组织切割成厚度为20 40 μ m切片，置于载玻片上； (4)材料染色:用移液枪或者移液管吸取100 150μ L的样品染色负载缓冲液滴到置于载玻片的切片上，然后将载玻片置入抽真空器皿中，密封后用真空泵抽气5 8min，随后在25°C条件下避光放置5 lOmin，用移液枪吸掉样品上的染色负载缓冲液，之后用移液枪吸取蒸馏水漂洗染色后的切片； (5)将100μ L50%甘油滴在切片表面，然后用盖玻片封片； (6)显微镜观察拍照:将经过步骤(5)处理的切片放置在落射荧光显微镜上，用激光激发装置激发，在显微镜下观察，并用CXD图像采集系统拍照。
2.根据权利要求1所述的一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，其特征是，所述的锋利刀片为剃须刀片或手术刀片。
3.根据权利要求1所述的一种小麦组织胼胝质的快速检测方法，其特征是，所述的激发装置激发波长为400 485nm,发射波长为490 560nm。
全文摘要
一种小麦组织胼胝质的染色与观察方法，属于植物组织化学定位技术领域。主要包括以下步骤(1)配制溶液(2)材料处理；(3)切片制作；(4)材料染色；(5)制片(5)激光激发装置激发，荧光显微镜观察与拍照。本发明采用徒手切片方法，用胼胝质专一性荧光染料—水溶性苯胺蓝在碱性条件下对徒手制作的小麦组织切片进行染色，显著缩短样品切片制作、染色与观察周期，保证胼胝质定位准确。本发明可操作性强，所制作切片便于观察，采集图像清晰。
文档编号G01N21/64GK103149189SQ201310075848
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月11日 优先权日2013年3月11日
发明者孔令安 申请人:山东省农业科学院作物研究所