猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法，其包括供体微珠、受体微珠、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体及带His标签的E2蛋白抗原。本发明通过优化供体微珠、受体微珠、单克隆抗体、抗原以及血清等试验反应条件，建立了检测CSFV抗体的竞争AlphaLISA检测方法。利用本发明的试剂盒进行CSFV抗体的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗涤，不受溶血影响，检测成本低，检测时间短。
【专利说明】猪瘟病毒抗体竞争AIphaLISA检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪瘟病毒抗体的免疫学检测，具体涉及ー种猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒属的成员。由于CSFV的高致病力和高致死率，它已给养殖业造成了巨大的损失。猪感染高致病力毒株后在潜伏期即可造成感染，经历急性猪瘟或亚急性猪瘟临床症状的猪在出现症状前大量排毒，而耐过后的猪只体内有明显的CSFV抗体，且不再排毒。感染温和性毒株的猪呈慢性感染，在病死前会长期或间歇性地排毒。怀孕母猪可以通过胎盘感染胎儿导致流产、木乃伊化或产出弱猪、畸形胎等。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和过程并且是自限性的，但有效的将它们同猪瘟病毒区分是很重要的。我国自首次分离到该病毒以来，已先后在广东、上海、福建等多省暴发和流行，目前该病在我国已普遍存在。现有的检测方法主要有病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶技术，免疫胶体金技术，免疫荧光抗体染色技术，ELISA、PCR和real timePCR等，各有优缺，且特异性差异较大。同时，方法对样品和人员的要求较高。由于猪感染猪瘟病毒或免疫猪瘟疫苗均能产生相应的抗体，且抗体能较好的反应其免疫或感染病毒的情况，因此，可以通过检测CSFV的抗体来反应其免疫感染病毒情況。
[0003]AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近吋，激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号。具体来说，在680nm的激光照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。単体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量传递到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用吋，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA技术凭借一种专有的基于微珠的技木，将传统的ELISA转化为均相的“无需洗涤”的检测。
[0004]AlphaLISA技术所使用的稀土元素铕(Eu)，发射波长非常尖鋭，为615nm，从而大大减少了检测样品中杂质的干扰，可直接检测复杂样品(血清和体液)中的生物分子。在临床上，这非常适合測定人和动物的血清和体液样本。而此技术的高通量、高灵敏度、操作简便，能更准确、更省时的测定细胞因子等生物标志物。目前，已广泛用于药物筛选、细胞因子、病变基因、血清抗体等的检测。
[0005]中国发明专利申请(申请号为:201210031802.X，201210047016.9)分别公开了采用AlphaLISA技术检测肠道病毒71型衣壳蛋白(Ant1-EV71 VPl IgM)和甲型肝炎病IgM的方法。但是，目前尚无利用AlphaLISA技术检测猪瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的第一目的是提供一种猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，以及编码试剂盒中抗原的基因及其扩增该基因所用的引物。第二目的是提供一种用于食品安全检测的猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测方法。
[0007]为实现第一目的本发明采用的技术方案是猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，包括供体微珠、受体微珠、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体和带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原。
[0008]其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PE，AS101D (即Nickel chelateDonor beads (PE, AS101D)),浓度为80 u g/mL, 500 u L ;所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE, AL105C(即 Ant1-mouse IgG Acceptor beads (PE, AL105C))，浓度为 80 u g/mL, 500 y L ;所述带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与猪瘟病毒E2蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
[0009]前述的试剂盒，包括供体微珠80 U g/mL、受体微珠80 U g/mL、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原180nM/L ;使用吋，以总体积20 μ L计，每孔添加量为:受体微珠4 u L、供体微珠5 u L、180nM/L带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原5 u LU00nM/L猪瘟病毒抗E2蛋白单克隆抗体5 u L及待测样品1 μL
[0010]具体地，编码上述带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原的基因为CSFV E2基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.2。CSFV E2基因是通过RT-PCR扩增反应得到的；RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.4。
[0011]为实现本发明的第二目的所采用的技术方案是:ー种利用上述试剂盒进行猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测方法，包括如下步骤:
1)反应板的待测孔中每孔加入1μ L待测样本，对照孔中加入1μ L 1X稀释缓冲液；
2)每孔加入5μ L 180nM/L带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原和5 μ L 100nM/L猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体，1000rpm离心10 sec，室温23°C避光孵育1h ；
3)姆孔加入80μ g/mL受体微珠4 u L、80 μ g/mL供体微珠5 μ L, 1000rpm离心10sec，室温23°C避光孵育30 min ；
4)结果读取:将反应板置Enspire(PE) AlphaLISA检测系统中读值。
[0012]采用上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果:
利用本发明的试剂盒进行猪瘟病毒抗体的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，不需洗漆，不受溶血影响。
[0013]本发明的优点是(1)、操作简单，不需要洗涤；(2)、高特异性:抗原与抗体的特异性结合,均相的反应,所需样本体积小,仅需1 --L ;(3)、检测时间短:检测时间比传统的ELISA时间短，仅需1.5 h即可完成检测；(4)、灵敏度高:最低检测极限比普通ELISA高5~10倍；样本检测的检出率达到97.5% ; (5)、背景低，抗淬灭能力强:采用长波长激发，短波长发射，不会有来自荧光的背景；且利用时间分辨荧光的检测模式，进ー步降低了背景，确保结果的真实性，615nm的发射波长，非常尖鋭，基本没有来自样品的淬灭干扰，是进行血清、血浆、体液等复杂样品检测的理想选择；(6)、用途:可用于血清及其相关样本中猪瘟病毒抗体的快速检测。【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为CSFV E2基因全长的核酸扩增电泳图；其中第I泳道为CSFV E2基因的扩增产物，第M泳道为DL 2000 DNA marker ；
图2为重组表达质粒pET-CSFV-E2经Xho 1、Kpn I双酶切后电泳图；图中第I泳道为质粒pET-CSFV-E2经酶切后，第2泳道为空载体，第3泳道为质粒pET_CSFV_E2酶切前，第M 泳道为 15000 DL Marker ；
图3为CSFV E2蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果，第M泳道为预染蛋白分子量标准，从上至下分子量依次为97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD ;第I泳道为未诱导的对照；第2和3泳道为CSFV E2蛋白全长1-1122，分子量大小约为56 KD，与预期结果一致；
图4 His-标签CSFV E2全长蛋白的Western blot鉴定結果；第I泳道为空白对照、第2和3泳道为CSFV E2全长1-1122，分子量大小约为56KD，第M泳道为Western blot蛋白分子标准，从上至下分子量依次为 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0016]以下实施中使用的猪瘟病毒弱毒疫苗株为市售产品，保存于重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心。
[0017]一、CSFV E2重组蛋白原核表达质粒的构建及鉴定 1、目的片段扩增
1.1、RT-PCR 扩增
以猪瘟病毒弱毒疫苗株CSFV (GenBank N0.:NC_002657.1)的基因组为模板，进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增所需目的片段CSFV E2基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0018]上下游引物分别引入Kpn I和Xho I酶切位点，引物设计采用Primer Preier5( —种引物设计软件)，引物由宝生物(大连)公司合成，引物序列见表1。
[0019]表1引物序列
【权利要求】
1.猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于:包括供体微珠、受体微珠、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体和带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原； 其中，所述供体微珠为螯合镍的供体微珠，PEjASIOID ;所述受体微珠为抗鼠IgG受体微珠，PE，AL105C ;所述带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有与猪瘟病毒E2蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于:所述供体微珠80 u g/mL、受体微珠80 u g/mL、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体100nM/L及带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原180nM/L ； 使用时，以总体系20 ii L计,每孔添加量为:80 u g/mL供体微珠5 y L、80 y g/mL受体微珠4 ii L、180nM/L带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原5 y L、100nM/L猪瘟病毒抗E2蛋白单克隆抗体5 ii L及待测样品I Uし
3.根据权利要求1或2所述猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于:编码所述带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原的基因为CSFV E2基因，其核苷酸序列为SEQID N0.2。
4.根据权利要求3所述猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于:所述CSFV E2基因是通过RT-PCR扩增反应得到的；RT-PCR扩增反应的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.4。
5.利用权利要求1所述猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒检测猪瘟病毒抗体的非疾病诊断目的的检测方法，包括以下步骤: 1)反应板的待测孔中每孔加入IU L待测样本，对照孔中加入IuLlX稀释缓冲液； 2)每孔加入5ii L 180nM/L带His标签的猪瘟病毒E2蛋白抗原和5 y L 100nM/L猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体，IOOOrpm离心10 sec，室温23°C避光孵育Ih; 3)姆孔加入80ii g/mL受体微珠4 u L、80 y g/mL供体微珠5 y L, IOOOrpm离心10sec，室温23°C避光孵育30 min ； 4)结果读取:将反应板置Enspire(PE) AlphaLISA检测系统中读值。
【文档编号】G01N33/68GK103499693SQ201310472881
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】聂福平, 杨俊 , 王昱, 李贤良, 李应国, 肖进文 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心