一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，首先对样品进行横向二维扫描，根据得到荧光寿命分布和荧光光斑进行横向对准，然后对单颗荧光颗粒进行轴向扫描成像，分析带有荧光强度与寿命分布的轴向二维图像，调节连续损耗光的发散度，完成光斑的轴向对准。本发明还公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置。本发明装置结构简洁，方便快速高精度调整，无需因采用纳米金颗粒而添加额外探测光路；调节精度高，光斑对准精度可达纳米量级。
【专利说明】一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置
【技术领域】
[0001]本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种受激发射损耗显微术中基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置。
【背景技术】
[0002]共聚焦荧光显微术具有非侵入性、高特异性和高灵敏度等优点，一直是生命科学领域中的重要研究方法。但是由于光波的衍射效应，其成像分辨率被局限于半个波长左右，无法满足当前生命科学的研究需求。
[0003]为了打破光波衍射极限的限制，进一步探索生命的本质和疾病的机理，科学家们致力于超分辨光学显微术的研究，自20世纪90年代起，已提出了多种光学超分辨显微方法:受激发射损耗显微术(Stimulated emission depletion microscopy, STED),光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy, PALM),随机光学重建显微术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM),饱和结构光照明显微术(saturated structured illumination microscopy, SSIM),等等。在这些方法之中，STED超分辨显微术目前具有最快的记录速度和最具前途的应用前景。
[0004]STED超分辨显微术首先是由S.ff.Hell于1994年提出的。在一个标准的STED超分辨显微系统中，一束相位编码的红移损耗光被引入共焦系统，通过高数值孔径显微物镜的聚焦在焦平面产生一个环形中空光斑(donut spot)。损耗光通过受激辐射作用消耗掉激发光实心聚焦光斑外围的激发电子，抑制光斑外围的自发荧光效应进而获得更小的有效点扩散函数(Point Spread Function, PSF)。因此,最佳的STED成像效果需要激发光的实心聚焦光斑中心和损耗光的环形中空聚焦光斑中心精确重合。传统的方法中，两聚焦光斑中心对准是通过两束光分别扫描纳米金颗粒进行成像，然后通过对比两幅像调整两束光聚焦光斑的相对位置，多次重复直至光斑中心重合。这种对准方法存在以下几个缺点:①需要额外添加散射光成像光路:因为STED显微系统本身针对荧光波长，收集部分装有滤除激发光和损耗光的滤光片，而纳米金颗粒则是利用激发光和损耗光的散射光来成像，因此若要采用纳米金颗粒对准需要添加额外光路；②激发光和损耗光需要单独扫描成像，其间的样品漂移会产生误差需要校正:常见的采集系统多采用雪崩二极管(APD)来记录扫描强度，但是APD无法分辨收集信号的波长，因此激发光和损耗光需要单独扫描成像，对比两次扫描结果，势必会引入样品漂移误差。2013年，有国外课题组提出了采用荧光颗粒对STED中两束光的聚焦光斑中心进行对准(Auto-aligning stimulated emission depletion microscopeusing adaptive optics.0ptics letters, 2013),但是其方法并没有克服分时扫描引入样品漂移误差等问题，另外该方法是通过荧光强度分布来确定聚焦光斑中心的，荧光强度分布依赖于激发光和损耗光的强度比。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置，通过探测STED显微术中由于损耗光引起的荧光光斑横向和纵向荧光寿命分布变化，调整寿命点扩散函数中心与对应荧光聚焦光斑中心的相对位置，从而对两聚焦光斑的中心进行三维对准。本发明结构简单，无需采用纳米金颗粒，无需添加额外光路，无需分时扫描成像，对准精度在纳米量级，特别适用于激发光为脉冲光、损耗光为连续光的STED超分辨显微系统。
[0006]一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，包括以下几个步骤:
[0007]I)同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；
[0008]2)横向移动所述的荧光样品，重复步骤1)，获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和突光寿命信息；
[0009]3)对步骤2)获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的突光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述突光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；
[0010]4)根据步骤3)算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；
[0011]5)对步骤3)中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤I)中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的突光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的突光强度信息和荧光寿命信息；
[0012]6)根据步骤5)中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及所述荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。
[0013]以荧光样品的颗粒稀疏区域作为所述步骤2)中的扫描区域，所述颗粒稀疏区域确定方法为:单独使用脉冲激发光，并将脉冲激发光调制为圆偏光，然后由显微物镜聚焦到样品表面，对样品表面进行二维扫描，收集荧光颗粒发出的荧光，得到相应的扫描图像，根据所述扫描图像上荧光颗粒的分布，选取所述的颗粒稀疏区域。
[0014]其中，脉冲激发光在经过脉冲激发光快门之前已调制为平行光；连续损耗光在经过连续损耗光快门之前已调制为平行光，且已经过了相位调制，相位调制的作用是为了在之后在显微物镜的聚焦作用下聚焦光斑成中空面包圈形光斑。
[0015]其中，脉冲激发光经显微物镜的聚焦光斑与最终收集信号的多模光纤端面在系统中互为共轭点。
[0016]其中，所述的荧光样品为100纳米荧光颗粒，因为100纳米荧光颗粒有较好的抗漂白能力，也可以采用40纳米?80纳米尺寸的荧光颗粒。
[0017]在步骤2)中，还可以采用振镜扫描系统来实现样品的横向扫描。
[0018]本发明还提供了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，包括:
[0019]沿脉冲激发光光路依次布置的脉冲激发光生成装置和脉冲激发光快门；
[0020]沿连续损耗光光路依次布置的连续损耗光生成装置、连续损耗光快门和二色镜；
[0021]四分之一波片，用于将所述的脉冲激发光和连续损耗光调制为圆偏光；
[0022]显微物镜，用于将所述圆偏光聚焦至荧光样品并收集荧光；[0023]信息采集装置，用于采集所述显微物镜收集荧光的强度信息和寿命信息；
[0024]以及与所述信息采集装置连接的计算机。
[0025]其中，所述的脉冲激发光生成装置包括沿光路依次布置的脉冲激光器、第一单模保偏光纤、第一准直透镜、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。
[0026]其中，所述的连续损耗光生成装置包括沿光路依次布置的连续激光器、第二单模保偏光纤、第二准直透镜、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和O?2 π涡旋位相板。
[0027]其中，所述的信息采集装置包括沿收集荧光的光路依次布置的滤光片、透镜、多模光纤、雪崩二极管和时间相关单光子计数系统，且时间相关单光子计数系统分别与所述的计算机和脉冲激发光生成装置连接。
[0028]滤光片用于滤除除自发辐射荧光波长外其他任何波长的光，透镜用于将收集到的突光聚焦于多模光纤端面，多模光纤与雪崩二极管(APD)相连,雪崩二极管(APD)时间相关单光子计数(TCSPC)系统相连，时间相关单光子技术系统与计算机相连，时间相关单光子计数系统负责将雪崩二极管记录的光子数和光子寿命信息提供给计算机。
[0029]本发明的工作原理如下:
[0030]经相位调制的脉冲激发光和连续损耗光在显微物镜的聚焦作用下在横向分别形成实心圆形聚焦光斑和环形中空聚焦光斑，在轴向分别形成实心椭圆形聚焦光斑(椭圆长轴沿光轴方向)和瓶颈形中空光斑。
[0031]荧光寿命是指荧光分子在激发态的分子数目衰减到原来的Ι/e所经历的时间，即荧光分子在上能级上的“平均停留时间”。若只开启激发光，则激发光聚焦光斑范围内荧光分子都将被激发至上能级并自发辐射跃迁发射荧光，则不考虑其他环境因素下整个激发光斑范围内任意一点突光寿命的表达式可以写成
[0032]τ (r)=l/kf
[0033]其中，kf是荧光分子自发辐射跃迁发射荧光的速率，对于给定的荧光分子种类来说kf值是确定的，则若只开启激发光，则最后单颗荧光颗粒对应的荧光寿命是均一的，如图3所示。
[0034]若同时开启激发光和损耗光，则激发光聚焦光斑范围内突光分子都将被激发至上能级，与只开启激发光不同，激发光斑范围内突光寿命的表达式需要修订为
[0035]τ (r)=l/(kf+o Isted (r))
[0036]其中，kf是荧光分子自发辐射跃迁发射荧光的速率，对于给定的荧光分子种类来说卜值是确定的，O是荧光分子受激辐射的吸收截面，ISTED(r)是聚焦光斑内r处的损耗光强度，即存在损耗光的区域荧光寿命缩短，且缩短程度与损耗光的强度有关，则若环形中空损耗光聚焦光斑与实心激发光聚焦圆斑重合时，重合光斑中心寿命最长，如图4所不。
[0037]根据100纳米荧光颗粒对应重合光斑荧光寿命分布进行纳米精度对准，如下表所示:
[0038]
【权利要求】
1.一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，其特征在于，包括以下几个步骤: O同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命； 2)横向移动所述的荧光样品，重复步骤1)，获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和荧光寿命信息； 3)对步骤2)获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述突光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离； 4)根据步骤3)算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准； 5)对步骤3)中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤I)中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的突光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的突光强度信息和荧光寿命信息； 6)根据步骤5)中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。
2.如权利要求1所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，以荧光样品的颗粒稀疏区域作为 所述步骤2)中的扫描区域。
3.如权利要求2所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，所述颗粒稀疏区域确定方法为: 单独使用脉冲激发光，并将脉冲激发光调制为圆偏光，然后由显微物镜聚焦到样品表面，对样品表面进行二维扫描，收集荧光颗粒发出的荧光，得到相应的扫描图像，根据所述扫描图像上荧光颗粒的分布，选取所述的颗粒稀疏区域。
4.如权利要求1所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，其特征在于，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为经相位调制后的平行光。
5.一种基于突光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，包括: 沿脉冲激发光光路依次布置的脉冲激发光生成装置和脉冲激发光快门； 沿连续损耗光光路依次布置的连续损耗光生成装置、连续损耗光快门和二色镜； 四分之一波片，用于将所述的脉冲激发光和连续损耗光调制为圆偏光； 显微物镜，用于将所述圆偏光聚焦至荧光样品并收集荧光； 信息采集装置，用于采集所述显微物镜收集荧光的强度信息和寿命信息； 以及与所述信息采集装置连接的计算机。
6.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的脉冲激发光生成装置包括沿光路依次布置的脉冲激光器、第一单模保偏光纤、第一准直透镜、第一起偏器、第一四分之一波片和第一二分之一波片。
7.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的连续损耗光生成装置包括沿光路依次布置的连续激光器、第二单模保偏光纤、第二准直透镜、第二起偏器、第二四分之一波片、第二二分之一波片和O~2 π涡旋位相板。
8.如权利要求5所述的基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置，其特征在于，所述的信息采集装置包括沿收集荧光的光路依次布置的滤光片、透镜、多模光纤、雪崩二极管和时间相关单光子计数系统，且时间相关单光子计数系统分别与所述的计算机和脉冲激发光生成装置 连接。
【文档编号】G01N21/64GK103543135SQ201310493645
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】匡翠方, 王轶凡, 刘旭, 修鹏, 方月 申请人:浙江大学