鹿流行性出血病病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种鹿流行性出血病病毒(EHDV)抗体快速检测试纸条及其制备方法。其主要应用截短的EHDV?VP7表达抗原作为检测线试剂。利用抗原表位分析软件对EHDV?VP7进行分析，选取含有主要抗原表位的片段，对其对应的密码子进行优化，根据优化后的核苷酸序列，人工合成DNA片段，构建重组表达载体，转化大肠杆菌进行蛋白质表达，获得了截短EHDV?VP7重组抗原，纯化后可用于EHDV抗体检测。基于该截短的EHDV?VP7抗原建立的快速检测试纸条具有操作方便、检测快速、不需专门实验室和设备等优点，克服了现有检测方法的局限，可用于EHDV抗体的快速检测和血清流行病学调查。
【专利说明】鹿流行性出血病病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物病毒学和动物传染病学领域，具体是一种用于检测鹿流行性出血病病毒抗体的快速检测试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]鹿流行性出血病(Epizootichemorrhagic disease of deer,EHD)是由鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease ofdeervirus,EHDV)引起的，以引起白尾鹿体温升高、黏膜和浆膜面广泛出血并常处于昏迷状态下死亡为特征的严重致死性传染病，牛和羊也可以感染发病，严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展。EHD是重要的虫媒病之一，库蠓是主要的传播媒介。世界动物卫生组织(OIE)将EHD列为法定报告传染病。虽然我国目前还没有EHD流行的报道，但由于EHD在很多国家和地区都有报道牛感染EHDV，如美国、澳大利亚、南美及非洲一些国家，随着国际动物和动物产品贸易的飞速发展，存在国外EHDV传入我国的风险。因此，EHD是我国进出口贸易中需要检测的重要疫病。
[0003]EHDV属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Obivirus)，EHDV基因组由10个片断(I?10)双股RNA组成，编码7个结构蛋白(VPl?VP7)和3个非结构蛋白(NSl、NS2、NS3 / NS3A)。VP7蛋白是EHDV的群特异性抗原，由S7基因编码，基因全长1162bp，由349个氨基酸组成。目前，EHDV共有8个血清型(I?8型)，重组VP7蛋白可以作为检测EHDV群特异性抗体的抗原，可以作为建立EHDV抗体检测方法的抗原。国外有学者用VP7作为抗原，建立EHDV抗体检测的竞争ELISA方法，其特异性和敏感性均优于琼脂扩散试验(AGID)。
[0004]目前，可用于EHDV抗体检测的方法有AGID、间接ELISA和竞争ELISA方法。由于EHDV与蓝舌病病毒(BTV)之间存在相同的免疫决定族，二者具有很强的免疫学交叉反应。用于检测EHDV抗体的AGID方法往往是应用EHDV全病毒作为抗原，与BTV阳性血清有很强的交叉反应。而VP7是EHDV群特异性抗原，与BTV阳性血清没有交叉反应，因此，VP7蛋白是建立EHDV抗体检测的方法的最佳抗原之一。
[0005]胶体金免疫层析试纸条(immunochromatographic strip)是20世纪90年代初期的发展起来的一种快速免疫学检测方法，该方法的核心技术是以条状纤维层析材料(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)为固相载体。用胶体金标记的蛋白质作为捕获检测靶物质的材料，在吸水垫的作用下，通过毛细作用使样品溶液反应物和胶体金标记物在固相载体以一定的速度向一端定向移动。通过在硝酸纤维素上形成的检测线和对照线来判定结果。这种检测方法具有快速、方便、特异、敏感、安全等特点。
[0006]本发明是用基因工程表达的截短的EHDV VP7蛋白抗原、胶体金标记的链球菌G蛋白(SPG)、硝酸纤维素膜等为主要材料，建立EHDV抗体免疫层析试纸检测方法，并研制了EHDV抗体快速检测试纸条。该方法具有特异性高、敏感性高、操作方便和检测快速等优点，由于国内目前尚无用于检测EHDV的相关试剂和试剂盒，该试纸可以用于EHDV抗体的快速检测、现场检测和进出口动物检疫，有助于了解国内EHDV抗体流行病学情况和有效防止境外EHDV传入国内。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服EHDV抗体现有检测方法的不足，提供一种具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作方便EHDV抗体检测方法。
[0008]该试纸条是应用截短的EHDV VP7表达抗原作为检测线试剂，并且根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏爱性，对截短的EHDVVP7蛋白对应的密码子进行了优化，根据优化后的核苷酸序列，人工合成DNA片段，构建重组表达载体，转化大肠杆菌进行蛋白质表达，获得了截短EHDV VP7重组抗原，纯化后可用于EHDV抗体检测。基于该截短的EHDV VP7抗原建立的快速检测试纸条具有操作方便、检测快速、不需专门实验室和设备等优点，克服了现有检测方法的局限，可用于EHDV抗体的快速检测和血清流行病学调查。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0010]UEHDV VP7蛋白抗原表位分析:通过检索NCBI数据库中EHDV VP7基因序列和对应氨基酸序列(AY351653)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，确定选择抗原表位位于EHDV VP7蛋白中第97?304氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1，其对应的核苷酸序列为第289?912nt位核苷酸(AY351653)。
[0011]2、密码子优化及EHDV VP7基因的扩增:根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏爱性，对选取的基因序列密码子进行优化，优化后的序列(mEHDV VP7)为序列表中SEQ IDN0.2，通过人工合成该序列，将该序列克隆至pMD-18T载体中。根据mEHDVVP7基因序列，设计特异性引物，在引物5'端人工添加LIC粘性末端。用PCR方法从人工合成的mEHDVVP7基因中扩增该片段，并进行DNA测序。
[0012]3、pET52 / LIC-mEHDV VP7重组表达载体的构建:用T4DNA聚合酶处理的上述PCR产物，并与商品化线性PET52 / LIc载体连接，构建pET52 / LIC-mEHDV VP7重组表达载体。通过PCR方法鉴定和DNA测序分析对构建的表达载体进行鉴定。
[0013]4,EHDV VP7重组蛋白的表达和纯化:将重组表达载体pET52 / LIC-mEHDV VP7转化(DE3)pLacI E.coli感受态细胞，在IPTG诱导下，进行蛋白表达，经SDS-PAGE和Westernblot分析，表达产物可与EHDV阳性血清发生特异性反应。使用6XHis标签融合蛋白纯化试剂盒对表达产物进行纯化。
[0014]5、金标复合物垫的制备:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，调胶体金溶液的PH值为6.5，冷却至室温后。采用室温搅拌法将适量SPG溶液加入胶体金溶液中进行标记，用卵白蛋白(OVA)进行封闭，标记结束后，采用差速离心对标记物进行纯化，用XYZ3050点样平台将胶体金标记的SPG溶液喷于玻璃纤维棉上，制作成金标复合物垫。
[0015]6、兔抗SPG的制备:用SPG免疫2月龄家兔，制备兔抗SPG多克隆抗体，用蛋白A /G抗体纯化试剂盒从多克隆抗体中纯化IgG，作为对照线试剂。
[0016]7、检测线和对照线的制备:首先将硝酸纤维素膜粘贴于背衬表面，再将浓度为Img / mL的EHDVVP7重组蛋白溶液和浓度为1.5mg / mL的兔抗SPG抗体分别点在硝酸纤维膜上，作为检测线和对照线试剂。
[0017]8、试纸条的组装和切割:按图1所示，将背衬(I)和已点样检测线和对照线的硝酸纤维膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)、吸水垫(5)粘在一起，并于CM4000切条机中，将其切成3mm宽的试纸条，于4°C干燥保存备用。
[0018]9、试纸条的特异性、敏感性分析:用试纸条分别检测EHDV(1?8型)标准阳性血清样品、其它相关病毒包括赤羽病病毒(AKV)、O型口蹄疫病毒(FMDV O)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清样品及阴性对照样品。结果表明试纸条检测EHDV(1?8型)标准阳性血清样品时为阳性反应，检测其它病毒阳性血清及阴性对照样品时均为阴性。用试纸条检测5份系列稀释的EHDV阳性血清样品，同时用进口 ELISA试剂盒作对照，结果显示试纸条检测5份样品抗体滴度与ELISA检测结果相当。
[0019]10、试纸条与进口试剂盒检测之间比对:用试纸条和进口 ELISA试剂盒同时检测临床血清样品522份。根据检测结果计算得出，试纸条特异性为99.8%，敏感性为96.5%,试纸条和ELISA试剂盒检测结果之间的符合率为99.4%。
[0020]本发明的特点和优点:
[0021]本发明所制备的基因工程表达的截短的EHDV VP7蛋白，具有与抗EHDV多克隆抗体特异性结合的活性，并且与其它相关病毒阳性血清无交叉反应。表明基因工程表达的EHDV VP7蛋白可以用于建立EHDV抗体免疫学检测方法。利于基因工程表达的截短的EHDVVP7蛋白和胶体金标记的SPG作为主要材料，建立EHDV抗体检测试纸条，与ELISA试剂盒相t匕，该试纸条具有良好的特异性和敏感性，两种方法检测结果符合率为99.4%。该试纸条具有检测快速、操作简便、不需要专门的仪器设备和专业技术人员。另外，该试纸条易于保存和运输，使用检测样品量少，检测成本较低，操作安全，不造成环境污染。因此该方法特别适用于EHDV抗体现场检测、基层兽医诊断部门临床检测和养殖企业自行检测等。该试纸条的研制，为EHDV抗体检测和EHD流行病学调查提供良好的检测手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为鹿流行性出血病病毒抗体快速检测试纸条结构示意图。
[0023]1:背衬，2:硝酸纤维素膜，3:金标复合物垫，4:样品垫，5:吸水垫，6:检测线，7:对照线。
[0024]图2为SDS-PAGE和Western-blot分析基因表达的EHDV VP7蛋白。
[0025]A =SDS-PAGE分析结果，B:Western_blot分析标准，M:蛋白分子量标准，I和3:转化pET52 / LIC-mEHDV VP7质粒的阳性菌，2和4:转化pET52 / LIC质粒的对照菌。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:截短的EHDVVP7蛋白的表达
[0027]1、EHDV VP7蛋白抗原表位分析和密码子优化:通过检索NCBI数据库中EHDV VP7基因序列和对应氨基酸序列(AY351653)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，确定选择抗原表位位于VP7蛋白中第97?304氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1,其对应的核苷酸序列为第289?912nt位核苷酸(AY351653)。
[0028]2、EHDV VP7基因密码子优化和人工合成:密码子优化，即根据表达系统对氨基酸密码子的偏爱性，对基因序列进行重新设计，将基因序列中利用率低或稀有的密码子修改为表达系统使用频繁的密码子，确保所表达蛋白的氨基酸序列不变。根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对选取的基因序列(SEQ ID N0.1)密码子进行优化，优化后的基因序列标记为mEHDVVP7，其序列为序列表中SEQ ID N0.2，通过人工合成该序列，将该序列克隆至pMD_18T载体中。经密码子优化后，mEHDV序列如下(下划线表示对应的碱基是经过了优化):
[0029]
【权利要求】
1.一种用于鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease ofdeer virus,EHDV)抗体检测的快速检测试纸条。其特征在于使用了截短的EHDVVP7基因工程表达抗原作为检测线试剂。该试纸条可以用于EHDV抗体的快速检测。
2.根据权利要求1中所述的，截短的EHDVVP7片段是通过使用抗原表位分析软件分析后选择长度为208个氨基酸的片段，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1。
3.根据权利要求1中所述的，截短的EHDVVP7蛋白对应的核苷酸序列是经过密码子优化的序列，其序列为序列表中SEQ ID N0.2。
4.根据权利要求1中所述的，截短的EHDVVP7基因工程表达抗原是通过PCR扩增经过密码子优化的EHDV VP7基因片段(mEHDV VP7)，将扩增的基因片段插入pET52 / LIC载体中，构建PET52 / LIC-mEHDV VP7重组表达载体，将载体转化大肠杆菌，进行表达所得到的重组蛋白抗原，该重组抗原可用于EHDV抗体检测。
5.根据权利要求4所述的PCR扩增mEHDVVP7基因片段，是根据密码子优化后的核苷酸序列，设计特异性引物，并在引物的5'端分别加入LIC位点，其序列为序列表中SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4。
【文档编号】G01N33/569GK103645317SQ201310636515
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】杨俊兴, 孙洁, 连慧香, 陈兵, 花群义, 吕建强, 曹琛福, 张彩虹, 卢体康, 胡运发, 秦智锋, 刘建利 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心