双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应用。该阳离子型荧光探针的结构式为其是以荧光量子产率高、对微环境极性敏感的丹磺酰作为信号输出基团，通过二乙烯三胺两端保护引入丹磺酰，然后二乙烯三胺两端脱保护与溴乙酰溴反应，最后与N-甲基咪唑共价结合，合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其化学稳定性好，能够即时、在线测定氨基酸，对天冬氨酸或谷氨酸的响应速度快、灵敏度高、响应范围宽，检出限可分别达到1.6μmol/L和6.0μmol/L，实现了氨基酸的高选择性、高灵敏度、低检出限检测。
【专利说明】双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针及其合成方法和应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于氨基酸的检测【技术领域】，具体涉及一种在水中测定氨基酸的荧光探针 及其合成方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，对生物化学和整个生命科学研 究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义。因此，氨基酸分析是工业、医药、农 业生产、食品加工及生命科学研究中十分重要的技术之一。其中天冬氨酸通过脱氨生成草 酰乙酸而促进三羧酸循环，并且与鸟氨酸循环密切相关，担负着使血液中的氨转变为尿素 排泄出去的部分工作。同时，天冬氨酸还是合成乳清酸等核酸前体物质的原料，可作为K+、 Mg2+离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉 循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。谷氨酸和天冬氨酸具有兴奋性递质作用，当谷氨酸含 量达9 %时，只要增加10?15mol的谷氨酸就可对皮层神经元产生兴奋性影响。因此，谷氨 酸对改进和维持脑功能必不可少。谷氨酸也可用于治疗肝昏迷等症，谷氨酸、天冬氨酸主要 用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科 营养和解毒等。此外氨基酸衍生物给癌症治疗上带来了希望。由此可见，氨基酸在人体生 命活动中十分重要。
[0003] 目前，有关氨基酸分离与测定的方法正在不断发展与完善之中，包括化学法、分光 光度法、色谱法、毛细管电泳法及其它方法。但是化学法试剂耗量多，测定周期长。分光光 度法操作简单、时间短，但是误差大、计算繁琐。色谱法仪器复杂、价格昂贵、用途单一、分 析时间较长（目前约减至1小时）、破坏氨基酸的固有结构、灵敏度相对较低。而荧光化学 传感器由于其具有制备简单、易于操作、灵敏度高、选择性好及可用于体外或活体测量、实 时在线检测，能够成像和输出信号丰富（比如：荧光强度、最大发射波长、光谱形貌、荧光寿 命和荧光各向异性等）等优点，采用荧光化学传感器对氨基酸进行检测，则可以很好地解 决上述问题。杨清正小组将荧光物种氟硼二吡咯（B0DIPY)在乙腈-水混合溶液中实现对 半胱氨酸（Cys)的高灵敏传感。Xiaoming Feng等人用手性联二萘酚（BIN0L)作为荧光化 学传感器实现了在乙腈-水的混合溶液中对谷胱甘肽和半胱氨酸的检测。Chengjian Zhu 小组制备了一种与Zn2+-比一配位的聚合物为荧光探针分子实现了在四氢呋喃中对具有 手性异构体的丙氨酸区分检测，然而这些传感器只能在有机溶剂和水的混合溶液中进行检 测，然而实现在水中对氨基酸的检测具有十分重要的意义。同时对天冬氨酸和谷氨酸的荧 光识别检测鲜为报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述氨基酸检测技术的缺点，提供一种灵敏 度高、选择性好、测试范围广且可实现水溶液中检测氨基酸的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子 型荧光探针，并为该荧光探针提供一种合成方法，以及合成的荧光探针在检测天冬氨酸或 谷氨酸中的应用。
[0005] 解决上述技术问题所采用的技术方案是：该荧光探针的结构式如下所示：
[0006]
【权利要求】
1. 一种双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式如下 所示：
2. -种权利要求1的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征在于 它由下述步骤组成： (1) 合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺 以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将二乙烯三胺与叔丁基苯基碳酸酯、三乙胺按摩尔比为 3. 2?5:8?12:1，在氮气保护、冰浴条件下搅拌12?24小时，分离纯化产物，得到式I所 示的两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺；
(2) 合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物 以三氯甲烷为溶剂，将两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩尔比 为1?1. 5:1:2?3. 5,在氮气保护、常温条件下搅拌12?36小时，所得反应液用饱和食 盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，依次用正己烷与乙酸乙酯的体积比为 5?8:1的混合物、正己烷与乙酸乙酯的体积比为1:1的混合物、二氯甲烷和甲醇的体积比 为50?60:1的混合物作为洗脱液柱层析纯化产物，真空干燥，得到式II所示的两端叔丁氧 羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(3) 合成两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物 以二氯甲烷为溶剂，将两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、三氟醋酸按 摩尔比为1:80?90,在氮气保护、冰浴条件下搅拌12?24小时，蒸除二氯甲烷，加入蒸馏 水溶解，然后用饱和碳酸钠水溶液调节pH至9?11，用三氯甲烷萃取，有机层用无水硫酸钠 干燥，蒸除三氯甲烷，真空干燥，得到式III所示的两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物；
(4) 合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物 以三氯甲烷为溶剂，将两端氨基的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩尔 比为1:2. 5?4:25?27,在氮气保护、冰浴条件下搅拌36?48小时，所得反应液用去离 子水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，蒸除三氯甲烷，用石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:3? 5的混合液作为洗脱柱层析纯化产物，真空干燥，得到式IV所示的两端溴的二乙烯三胺丹磺 酰衍生物；
(5) 合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针 以四氢呋喃为溶剂，将两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩尔比为 1:4?6,在氮气保护下加热回流48?72小时，抽滤，所得固体在丙酮中加热回流8?12 小时，抽滤，用乙醚淋洗，得到双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针。
3. 根据权利要求2所述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征 在于：在合成两端叔丁氧羰基保护的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤（2)中，所述的两端叔 丁氧羰基保护的二乙烯三胺、丹磺酰氯、三乙胺按摩尔比为1?1. 3:1:2. 5?3。
4. 根据权利要求2所述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征 在于：在合成两端溴的二乙烯三胺丹磺酰衍生物步骤（4)中，所述的两端氨基的二乙烯三 胺丹磺酰衍生物、溴乙酰溴、三乙胺按摩尔比为1:3?3. 5:25?27。
5. 根据权利要求2所述的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针的合成方法，其特征 在于：在合成双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针步骤（5)中，所述的两端溴的二乙烯 三胺丹磺酰衍生物、N-甲基咪唑按摩尔比为1:4?5。
6. 权利要求1的双咪唑丹磺酰衍生物阳离子型荧光探针在检测氨基酸中的用途，所述 的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
【文档编号】G01N21/64GK104151248SQ201410341279
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】丁立平, 曹建华, 王世怀, 胡雯婷, 薛思琪, 陈霄 申请人:陕西师范大学