本发明属于药物分析学领域，涉及一种分离纯化方法，特别涉及一种分离纯化粪便样品中原人参二醇体内代谢产物的方法。
背景技术：
现有技术公开了原人参二醇是原人参二醇型人参皂苷的体外水解产物，从结构上看，其属于达玛烷型四环三萜类人参皂苷元化合物，分子式为c30h52o3，分子量为460.70，熔点197.5-198.5摄氏度，研究表明其具有与人参皂苷相似的药理学活性，包括抗肿瘤作用、抑制癫痫发作、抗抑郁作用等。目前，原人参二醇作为一种抗抑郁的一类新药已经进入临床试验阶段，因此，研究其在人体内代谢过程为保证用药安全性和可靠性起着重要作用。
现有技术中，由于人参皂苷类物质在质谱检测器中具有一定的裂解规律特性，且其代谢产物结构类似，均具有相似的裂解规律，因此使用质谱数据推断代谢产物结构具有一定的局限性和不确定性，基于此，本申请的发明人拟建立一种分离纯化原人参二醇体内代谢产物的方法，以进一步制备代谢产物纯品，进而为核磁共振检测确定未知化合物结构提供基础，以及为原人参二醇体内代谢过程提供可靠的分析手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种准确、高效的原人参二醇体内代谢产物分离纯化方法；特别是一种分离纯化粪便样品中原人参二醇体 内代谢产物的方法。本方法能为进一步制备代谢产物纯品，进而为核磁共振检测确定未知化合物结构提供基础，以及为原人参二醇体内代谢过程提供可靠的分析手段。
具体的，本发明的一种原人参二醇体内代谢产物分离纯化方法，其特征在于，其包括，采用硅胶层析柱粗分离,再使用质谱引导的制备液相纯化，两种分离方法结合，使用更快地制得代谢产物纯品。
本发明中，所述硅胶层析柱填料为200-300目硅胶粉末；所选用的该特定尺寸硅胶作为分离填料可以快速实现粗分离。
本发明中，所述硅胶层析分离洗脱液为乙酸乙酯和石油醚；所选用的乙酸乙酯和石油醚作为洗脱液可以对各种极性的组分实现分离。
本发明中，所述乙酸乙酯和石油醚洗脱依次比例为1:6,1:4,1:2,1:1,2:1,4:1,6:1；该连续比例乙酸乙酯和石油醚的洗脱，可以将极性相近的多种代谢产物洗脱下来。
本发明中，制备液相的流动相为0.1％tfa水溶液(a)和乙腈(b)，流速为15ml/min，洗脱条件为0-5min50％a+50％b；5-15min40％a+60％b；15-80min30％a+70％b；80-90min100％b，监控m/z为493.39、491.37、477.39、475.38，阈值为1e5，进样量为1ml；所采用的水和乙腈采用梯度条件洗脱可以在短时间内实现多种代谢产物的分离纯化。
本发明的实施例中，采用的待分离样品为粪便；所述粪便作为待分离样品具有易采集、易累积的特点，可实现大量代谢产物的制备。
本发明的技术方案的有益之处在于：
硅胶层析柱分离与制备液相分离连续应用可以快速、高效、一次纯化得到多 种代谢产物纯品；硅胶层析柱和制备色谱梯度洗脱条件可以在短时间内实现多种未知物质的分离纯化；以粪便作为待分离样品，价格低廉、易于采集和累积，便于分离纯化制得大量代谢产物。
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述。
附图说明
图1是原人参二醇体内代谢产物分离纯化色谱图，
图中：(a)为m/z475的色谱图，62.5min分离纯化得到代谢产物475；(b)为m/z477的色谱图，68.7min分离纯化得到代谢产物477；(c)为m/z491的色谱图，35.0min分离纯化得到代谢产物491；(d)为m/z493的色谱图，32.5min分离纯化得到代谢产物493。
具体实施方式
实施例1
1.给药方案
1.1ppd混悬液配制
取0.5g羧甲基纤维素钠加入100ml去离子水，40℃水浴加热并搅拌，直至其完全溶解。取500mg的ppd原料药，加入上述0.5％羧甲基纤维素钠溶液100ml，充分混匀后4℃保存待用；
1.2给药与样品收集
取雄性s.d.大鼠10只，每只体重在250～300g之间，置于代谢笼中，适应性喂养1周后，每日上午9点按50mg/kg体重灌胃给药1次，连续给药40天；从day2起每日收集代谢笼中粪便，大鼠粪便采集后尽量挑拣出食物残渣，然后置于烘箱中40℃低温烘焙，干燥后-20℃密封保存；
1.3代谢产物粗提
取干燥的大鼠粪便2kg，用粉碎机充分粉碎后置于10kg油桶中，加入8l甲醇摇匀，18℃空调房内浸出2天，白天每隔2小时混匀1次；取上层浸出液约6l，滤纸过滤3次，旋转蒸发至全水相，乙醚/二氯甲烷液液萃取3次，合并后再旋转蒸发萃取液，得提取残渣；
1.4制备层析柱色谱分离
取适量二氧化硅粉末装填至具标口砂芯四氟节门层析柱(100*300/24#)，二氯甲烷溶解提取残渣后上样；分别用石油醚/乙酸乙酯(v/v)比例1:0、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、0:1逐步洗脱，分段收集，取各分段洗脱液进行uplc-q-tof鉴定，对含目标代谢产物的组分旋干回收，得一系列粗提物；
1.5制备高效液相色谱分离
取4.5ml甲醇溶解8号粗提物，进一步进质谱引导的高效液相制备色谱分离，流动相为0.1％tfa水溶液(a)和乙腈(b)，流速为15ml/min，洗脱条件为0-5min50％a+50％b；5-15min40％a+60％b；15-80min30％a+70％b；80-90min100％b，监控m/z为493.39、491.37、477.39、475.38，阈值为1e5，进样量为1ml；取所得精制分离液分管进一级质谱分析确认，对浓度最高的分离液旋干，剩余水份冻干处理，得代谢产物；
2.结果
2.1动物实验与提取结果
在试验开始之后，10只s.d.大鼠饮食、饮水、排便、排尿、活动均正常，无明显不良反应；其中9号s.d.大鼠在第16日早上灌胃后死亡，解剖发现属操作不当所致，与给药无关，其余9只s.d.大鼠均完成试验，试验共收集大鼠粪 便2.3kg，甲醇提取后得黄褐色固体状提取残渣30.05g；
2.2层析柱色谱粗提结果
层析洗脱共消耗洗脱溶剂约38l，分离样品为13份，其中0号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:0，收集4l；1号组分，石油醚/乙酸乙酯为6:1，收集6l；2号组分，石油醚/乙酸乙酯为4:1，收集4l；3号组分，石油醚/乙酸乙酯为2:1，收集4l；4号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:1，收集2.5l；5号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:1，收集2.5l；6号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:2，收集2l；7号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:2，收集2l；8号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:4，收集2.5l；9号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:4，收集2.5l；10号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:6，收集2l；11号组分，石油醚/乙酸乙酯为1:6，收集2l；12号组分，石油醚/乙酸乙酯为0:1，收集2l。uplc-q-tof高分辨质谱分析发现5号组分-12号组分均不同比例地含有各种代谢产物，其中8号组分同时含有m/z比为475、477、491、493的代谢产物成分，且含量较高。旋干8号组分得约800mg黄褐色油状物；
2.3高效液相制备色谱精制结果
按照所述方法对8号组分分4次进样进行分离纯化，保留时间31min的色谱峰为代谢产物493，保留时间34min的色谱峰为代谢产物491，保留时间60min的色谱峰为代谢产物475，保留时间66min的色谱峰为代谢产物477；对含有目标代谢产物的样品收集管中收集到的流动相进行一级质谱检测，确认收集的流动相为含目标代谢产物的洗脱液；分别合并4次纯化所得的同种代谢产物洗脱液，根据样品情况旋干或冻干，得约1.0mg代谢产物493、约1.7mg代谢产物491、约1.3mg代谢产物475、约1.0mg代谢产物477。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。