本发明涉及疾病检测
技术领域：
，更具体地，涉及非抗体结合蛋白在制备疟疾检测试剂中的应用。
背景技术：
：感染人类的主要疟原虫(Plasmodium)有5种：恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)以及诺氏疟原虫(P.Knowlesi)，其中恶性疟原虫和间日疟原虫在疫区的感染病率几乎各占一半，而恶性疟原虫感染是最致命的一种。在贫穷落后的国家和偏远地区，由于设备有限，疟疾的诊断往往依循临床症状的表现。然而，疟疾的症状与其他感染症不易区分，造成诊断上很大的困难。马拉威一项研究报告显示，以发烧、脾肿大及苍白的指甲三项作为疟疾诊断的依据只有85％敏感度与41％特异性，因此，以症状为导向的诊疗经常导致误诊。显微镜检查，至今仍是疟疾诊断的金标准。血液厚涂片用于筛检诊断与估算疟原虫的密度，薄片血涂片是目前鉴定疟原虫种类的标准方式。厚薄血涂片镜检法检测效率较低，要求技术熟练的镜检员，而且当原虫血症较低的时候容易造成漏诊和误诊。疟疾药物越来越昂贵，误诊是一个主要的费用负担，因此准确和敏感的诊断变得越来越重要。抗原快速检验是一种基于抗原-抗体特异性结合的原理建立的免疫学检测方法，因有着简单快速的优点，在各类感染性疾病的诊断上受到越来越多的关注并展示了广阔的应用前景。目前临床上免疫学检测方法中大量使用的多克隆抗体或单克隆抗体多为免疫球蛋白IgG形式，完整天然抗体由两条重链和两条轻链组成，分子量约150kDa。由于分子量较大，组织穿透性较低，无法与某些小裂隙中的分子表面结合，在某些方面的应用受到限制。这些抗体或来源于免疫动物、或通过杂交瘤细胞制备，部分来源于基因工程重组法生产，生产方法及其抗体本身的结构特点不仅使得其生产成本很难降低，而且存在不同批次之间的变异性以及抗体纯度的问题。为使得抗体选择可以根据人类的需要并赋予天然状态下不可能具备的新功能，越来越多的展示技术被用于研究构建各种基因工程抗体库和抗体替代物库。目前抗体替代物库从结构上分为两类，框架蛋白(scaffoldprotein)和RNA/DNA适配分子(Aptamer)。其中，框架蛋白是指这些非免疫球蛋白的抗体替代物在一级结构上与抗体分子完全不同，但在框架结构上与抗体可变区有相似结构特点。过计算机设计，在保证框架结构不变的基础上，对某一特定的蛋白分子表面区域的氨基酸组成进行随机化组合，从而构建类似于抗体库的框架蛋白文库，将其展示在噬菌体、细菌、酵母、细胞器或其他生物大分子表面，可用于筛选特异性识别各种抗原的非抗体结合蛋白(non-antibodybindingproteins，nABPs)。在欧美国家，几十种框架蛋白文库已被成功构建。一些特异识别癌细胞的框架蛋白也从框架蛋白文库中得到了成功地分离，并通过了临床实验，应用于癌症的诊断和药物靶向输送，有的已经实现了商品化。但在中国，新型框架蛋白文库的构建几乎为零。采用抗原快速检验，又称“dipsticks”或“malariarapiddiagnosticdevices(MRDDs)”来检测疟疾，一般是检测疟原虫内的HRP2或pLDH两种抗原，现有技术中还没有用于检测疟疾的非抗体结合蛋白。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供非抗体结合蛋白在制备疟疾检测试剂中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：非抗体结合蛋白在制备检测疟疾的试剂中的应用，所述非抗体结合蛋白为与恶性疟原虫乳酸脱氢酶反应的LDH9-5和/或LDH9及与恶性疟原虫富组氨酸蛋白II反应的HRP2-9和/或HRP2-9-1，其氨基酸序列如SEQIDNO：1～4所示。首先通过计算机设计和噬菌体表面展示技术构建了类似于抗体库的框架蛋白(scaffoldproteins)文库，框架蛋白文库中的非抗体结合蛋白(non-antibodybindingproteins，nABPs)在一级结构上与抗体分子完全不同，但在框架结构上与抗体可变区有相似的结构特点，因此可作为抗体替代物特异性识别、结合各种抗原。申请人通过在框架蛋白文库中筛选出了能够配对恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)和恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP2)的非抗体结合蛋白，因此可用于检测疟疾。其中，LDH主要是存在于间日疟中，HRP2主要存在于恶性疟，因此，优选地，所述疟疾为间日疟或/和恶性疟。具体的，可以将本发明所筛选出来的LDH9和HRP2-9固定于载体上作为包被抗体，以LDH9-5和HRP2-9-1作为检测抗体，然后通过常规的免疫反应(LDH9和LDH9-5配对，HRP2-9与HRP2-9-1配对)，即可用来检测待测样品中是否存在LDH和HRP2，更具体地，若免疫反应结果显示，LDH9作为包被抗体时的反应孔为阳性，HRP2-9作为包被抗体时的反应孔为阴性，则待测样品为间日疟；若LDH9作为包被抗体时的反应孔为阳性，HRP2-9作为包被抗体时的反应孔同样为阳性，那则待测样品为恶性疟。因此，本发明还提供非抗体结合蛋白在制备同时鉴别间日疟和恶性疟的试剂中的应用，所述非抗体结合蛋白为与恶性疟原虫乳酸脱氢酶反应的LDH9-5和/或LDH9及与恶性疟原虫富组氨酸蛋白II反应的HRP2-9和/或HRP2-9-1，其氨基酸序列如SEQIDNO：1～4所示。上述应用中，是将LDH9-5和HRP2-9-1作为检测抗体，将LDH9和HRP2-9作为包被抗体，其中LDH9-5和LDH9配对，HRP2-9-1和HRP2-9配对，所述LDH9和HRP2-9作为包被抗体的包被浓度为2～4μg/mL。作为一种具体的实施方式，本发明利用上述LDH9-5和HRP2-9-1检测疟疾的过程如下：S1.包被LDH9和HRP2-9于固相载体上，经封闭后干燥备用；S2.将处理过的待测样品加入包被有LDH9和HRP2-9的固相载体上，经室温反应后，再分别对应的加入标有生物素的LDH9-5和HRP2-9-1，反应后加入辣根过氧化物没标记的亲和素，最后加入TMB和稀硫酸终止反应，并检测450nm处的吸光值。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明从框架蛋白(scaffoldproteins)文库中筛选获得能够与恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)配对的LDH9-5和LDH9，和能够与恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP2)配对的HRP2-9和HRP2-9-1，能够特异性检测疟疾，并可同时鉴别间日疟和恶性疟，利用该配对的蛋白和非抗体结合蛋白，可用于制备疟疾检测试剂盒，解决了当前疟疾诊断推广普及时抗体生产和试剂盒的价格问题，可成为具有发展潜力的诊断工具，具有广泛的应用价值。附图说明图1为不同非抗体结合蛋白配对的反应的吸光值。图2为不同包被浓度下反应的吸光值。图3为不同疟原虫浓度下反应的吸光值。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1双抗夹心法检测CRP蛋白的实验平台验证1、实验器材的准备，其中主要包括了酶标仪(酶标仪使用前已经进行校正)、加样器等。2、CRP抗体的生物素标记：按照Sulfo-NHS-LC-Biotin(购自Thermo21335)产品说明书进行操作，将编号6402SPTN-5的CRP抗体(浓度4.3mg/ml)透析，取适量加入预先计算的NHS-LC-Biotin试剂，反应标记后透析并计算其浓度为：1.673mg/ml。3、包被板的制备：将编号为6403SPTN-5的CRP抗体(浓度为5mg/ml)透析后，取适量用pH9.6的碳酸盐(CB)包被缓冲液稀释至浓度3ug/ml，随后按100ul/孔加入到高吸附力的96微孔板中(购自深圳金灿华)进行包被。4℃下孵育18～24h，弃去包被液，加入含3％的BSA的封闭液150ul/孔，37℃封闭3h后干燥备用。4、双抗夹心法测试临床血清样本，与其他现成方法比对测试：(1)将待测血清样本(来自暨南大学附属第一医院-广州华侨医院)放置于室温平衡30min，待样本于室温平衡后，取适量样本按照1∶1000稀释后，取100ul/孔，按表1如下方案加入待测血清样本。表1123456789101112AStd1Std1S1S9S17S25S33S41S49S57S65S73BStd2Std2S2S10S18S26S34S42S50S58S66S74CStd3Std3S3S11S19S27S35S43S51S59S67BDStd4Std4S4S12S20S28S36S44S52S60S68BEStd5Std5S5S13S21S29S37S45S53S61S69BFStd6Std6S6S14S22S30S38S46S54S62S70BGStd7Std7S7S15S23S31S39S47S55S63S71BHStd8Std8S8S16S24S32S40S48S56S64S72B注：其中Std1～Std8为校准品编号，S1～S74为血清样本；B为空白对照孔。测试结果如表2所示。表2经校准计算S1～S74样本的浓度值，后将所得浓度值与华侨医院临床检测所提供浓度值比对，拟合R2＝0.9469，表明了该对抗体测试临床样本性能和目前医院所用的相关测试有比较好的相关性。进一步表明已建立的ELISA平台可以实现疟疾相关蛋白及抗体类似物之间特异性反应的检测。实施例2ELISA测试恶性疟HRP2及LDH相关蛋白性能1、抗体类似物蛋白(下简称nABPs)的生物素标记：将编号LDH9-5、LDH9-8两个恶性疟原虫乳酸脱氢酶(下简称LDH)抗体类似物(nABPs)及HRP2-9-7、HRP2-9-1、HRP2-9-9三个恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(下简称HRP2)抗体类似物(nABPs)在pH7.4的10mMPBS缓冲液下进行透析过夜(换液3次)处理，随后严格按照Sulfo-NHS-LC-Biotin标记的操作规程进行生物素标记操作，最后置于2～8℃冰箱保存备用。将标记好生物素的LDH及HRP2的nABPs稀释成5ug/ml并按100ul/孔包被于96微孔板中，4℃过夜，然后加入3％的BSA封闭液150ul/孔，封闭3h。同时空白对照孔用包被稀释液直接包被后封闭3h。将封闭好的包被板用PBST洗涤5次后，加入1∶5000的辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul/孔，室温反应1h。随后再用PBST洗涤5次，然后再加入单组份TMB底物显色液100ul/孔，室温反应15min后加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔终止反应，置于450nm波长下检测吸光度值(OD值)。判断结果要求：测试标记抗体的包被孔OD值不低于1.5。空白对照孔OD值不高于0.1，检测结果如表3。表312A3.040.074B3.0410.066C2.9930.058D3.0040.053E3.5910.071测试标记抗体孔最小OD值为2.993＞1.5，空白对照孔的最大OD值为0.074＜0.1，可进行下一步测试工作。实施例3nABPs蛋白的性能调试与测试(1)双抗夹心法的nABPs配对性测试：取适量的编号为LDH9的LDHnABPs及HRP2-9、HRP2-26的HRP2nABPs分别用pH9.6的CB缓冲液稀释至8ug/ml，按100ul/孔包被于96微孔板中，置于2～8℃过夜后弃去包被液，加入封闭液150ul/孔，封闭3h后，弃去封闭液，加入1∶1稀释的恶性疟原虫上清培养液(培养液的虫浓度为100个)100ul/孔，室温反应1h后用PBST洗涤5次，再分别对应包被LDH9及HRP2的nABPs中加入制备好的浓度5ug/ml的生物素标记LDH9-5、LDH9-8及HRP2-9-7、HRP2-9-1、HRP2-9-9的nABPs100ul/孔，室温反应1h后用PBST洗涤5次，随后加入1∶5000的辣根过氧化物酶标记亲和素100ul/孔，再置于室温反应1h后PBST洗涤5次，最后加入TMB底物显色液，室温反应15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔终止反应，于波长450nm下检测吸光度值，实验方案如表4。表4包被→LDH9HRP2-9HRP2-26ABiotin-LDH9-5Biotin-HRP2-9-7Biotin-HRP2-9-7BBiotin-LDH9-5Biotin-HRP2-9-7Biotin-HRP2-9-7CBiotin-LDH9-8Biotin-HRP2-9-1Biotin-HRP2-9-1DBiotin-LDH9-8Biotin-HRP2-9-1Biotin-HRP2-9-1EBiotin-HRP2-9-9Biotin-HRP2-9-9FBiotin-HRP2-9-9Biotin-HRP2-9-9试验结果如图1，结果表明选择编号LDH9作为包被与生物素标记LDH9-5配对，编号HRP2-9作为包被与生物素标记HRP2-9-1配对，编号HRP2-26与生物素标记HRP2-9-7配对，选择好配对后进行下一步的浓度选择测试。(2)包被的nABPs浓度选择测试：取适量的编号LDH9的LDHnABPs及HRP2-9、HRP2-26的HRP2nABPs稀释成8ug/ml进行测试，随后再进一步稀释成以下几个梯度：4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，并按100ul/孔包被于96微孔板中，置于2～8℃过夜后弃去包被液，加入封闭液150ul/孔，封闭3h后，弃去封闭液，加入1∶1稀释的恶性疟原虫上清培养液100ul/孔(100个寄生虫/ul)，室温反应1h后用PBST洗涤5次，再分别对应加入制备好的浓度5ug/ml的生物素标记LDH9-5及HRP2-9-1、HRP2-9-7100ul/孔，每组两个重复，室温反应1h后用PBST洗涤5次，随后加入1∶5000的辣根过氧化物酶标记亲和素100ul/孔，再置于室温反应1h后PBST洗涤5次，最后加入TMB底物显色液，室温反应15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔终止反应，于波长450nm下检测吸光度值，结果如表5(判断结果要求：选择饱和的包被反应的浓度，即选取反应曲线中趋向平台反应区的浓度作为包被浓度)，作图如图2，LDH的nABPs包被编号为LDH9的浓度选择2ug/ml进行包被，HRP2的nABPs包被编号为HRP2-9及HRP2-26的浓度分别选择2ug/ml及4ug/ml进行包被。表5包被→LDH9LDH9HRP2-9HRP2-9HRP2-26HRP2-26A3.343.333.0223.1213.0753.072B3.1413.2112.9943.0683.063.018C2.9992.9933.053.0022.6522.686D2.582.62.9462.8931.1471.348E1.5981.6062.522.5890.6840.678F0.9780.9521.6231.6250.3290.329(3)最低检测限(灵敏度)的测定：取适量的编号LDH9、HRP2-9、HRP2-26的nABPs用CB(PH9.6)进行包被，包被浓度分别为：2ug/ml，2ug/ml，4ug/ml。置于2～8℃冰箱包被18～24h，弃去包被液，加入封闭液150ul/孔，封闭3h后，弃去封闭液干燥备用。按照原来恶性疟原虫培养液浓度是4×104个/微升，随后按照1∶1稀释后再进一步对倍稀释后100ul/孔加入到制备好的包被板中，同时做空白孔对照测试重复24个孔，置于室温反应1h后用PBST洗涤5次，再分别对应加入制备好的浓度5ug/ml的配对生物素标记LDH9-5及HRP2-9-1、HRP2-9-7100ul/孔，室温反应1h后用PBST洗涤5次，随后加入1∶5000的辣根过氧化物酶标记亲和素100ul/孔，再置于室温反应1h后PBST洗涤5次，最后加入TMB底物显色液，室温反应15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔终止反应，于波长450nm下检测吸光度值，结果如表6。表6表6(续)判断标准：参考现行的其他方法学检测，要求最低检测限(即灵敏度)应不大于1000个寄生虫/微升，结果如图3。综合数据，并计算处理，结果如表7，显示HRP2-26与HRP2-9-7配对最低检测限为1653大于1000个疟原虫/微升，不符合检测要求，而LDH9与LDH9-5及HRP2-9与HRP2-9-1配对最低检测限分别为333及283个疟原虫/微升，符合检测要求。可以进一步用LDH9与LDH9-5及HRP2-9与HRP2-9-1进行下一步测试。表7实施例4nABPs的临床检测性能对比测试验证临界值(cutoff值)的确定方法：取多样本混合制成的疟疾阴性人全血，用选定的配对LDH9及HRP2-9进行测试，判定方法：以临界值(cutoff值)＝阴性对照均值×2；当检测结果≥临界值，判为阳性；当检测结果＜临界值，判为阴性；注意：当检测结果接近于临界值，需要重新测试，或者进一步做其他检测。根据实施例3测试筛选得到的针对检测LDH蛋白及HRP2蛋白的配对nABPs，即编号LDH9与LDH9-5配对检测LDH、编号HRP2-9与HRP2-9-1配对检测HRP2。将用于包被的LDH9及HRP2-9两种nABPs分别包被于高吸附力的96微孔板中，按照浓度分别为2ug/ml进行4℃包被18～24h，弃去包被液，加入含3％BSA的封闭液150ul/孔，封闭3h后，弃去封闭液干燥备用。按照原来恶性疟原虫培养液浓度是4×104个寄生虫/微升，随后稀释成5000个寄生虫/微升，以此浓度作为质控样本。另取适量经多样本混合的疟疾阴性的人全血进行按1：5稀释作为阴性对照样本。待测的疟疾阳性人全血样本也按1：5稀释后，以上质控样本、阴性对照样本、经稀释的待测人全血样本均按100ul/孔加入到制备好的包被板中，同时做空白孔对照，置于室温反应1h后用PBST洗涤5次，再分别对应加入制备好的浓度5ug/ml的配对生物素标记LDH9-5及HRP2-9-1100ul/孔，室温反应1h后用PBST洗涤5次，随后加入1：5000的辣根过氧化物酶标记亲和素100ul/孔，再置于室温反应1h后PBST洗涤5次，最后加入TMB底物显色液，室温反应15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔终止反应，于波长450nm下检测吸光度值，检测结果如表8。表8统计数据，并计算结果如表9，LDH试剂检测样本，阴性及阳性符合率分别为100％及93.75％；HRP2试剂检测样本，阴性及阳性符合率都为100％；以上两个检测试剂性能初步判断满足进一步的试剂开发要求。表9SEQUENCELISTING<110>广东合鑫生物科技有限公司<120>非抗体结合蛋白在制备疟疾检测试剂中的应用<130><160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>391<212>PRT<213>LDH9<400>1AspTyrGluThrSerSerAsnGlyGlnProAlaGlyThrLeuAspAsn151015ValLeuGluPheValThrGlyHisGluGlyAsnSerArgLysAsnSer202530SerAsnGlyGlyAsnProTyrAspIleAspHisLysLysThrIleSer354045SerAlaIleIleAsnHisAlaPheLeuGlnAsnThrValMetLysAsn505560CysAsnTyrLysArgLysArgArgGluArgAspTrpAspCysAsnThr65707580LysLysAspValCysIleProAspArgArgTyrGlnLeuCysMetLys859095GluLeuThrAsnLeuValAsnAsnThrAspThrAsnPheHisSerAsp100105110IleThrPheArgLysLeuTyrLeuLysArgLysLeuIleTyrAspAla115120125AlaValGluGlyAspLeuLeuPheLysLeuAsnAsnTyrArgTyrAsn130135140LysAspPheCysLysAspIleArgTrpSerLeuGlyAspPheGlyAsp145150155160IleIleMetGlyThrAspMetGluGlyIleGlyTyrSerLysValVal165170175GluAspAsnLeuArgSerIlePheGlyThrGlyLysAsnAlaGlnGln180185190HisArgLysGlnTrpTrpAsnGluSerLysAlaGlnIleTrpThrAla195200205MetMetTyrSerValLysLysArgLeuLysGlyLysPheIleTrpIle210215220CysLysIleAsnValAlaValAsnIleGluProGlnIleTyrArgArg225230235240IleArgGluTrpGlyArgAspTyrValSerGluLeuProThrGluVal245250255GlnLysLeuLysGluLysCysAspGlyLysIleAsnTyrThrAspLys260265270LysValCysLysValProProCysGlnAsnAlaCysLysSerTyrAsp275280285GlnTrpIleThrArgLysLysAsnGlnTrpAspValLeuSerAsnLys290295300PheLysSerValLysAsnAlaGluLysValGlnThrAlaGlyIleVal305310315320ThrProTyrAspIleLeuLysGlnGluLeuAspGluPheAsnGluVal325330335AlaPheGluAsnGluIleAsnLysArgAspGlyAlaTyrIleGluLeu340345350CysValCysSerValGluGluAlaLysLysAsnThrGlnGluValVal355360365ThrAsnValAspAsnAlaAlaLysSerGlnAlaThrAsnSerAsnPro370375380IleSerGlnProValAspSer385390<210>2<211>305<212>PRT<213>LDH9-5<400>2MetGlyIleLeuProSerProGlyMetProAlaLeuLeuSerLeuVal151015SerLeuLeuSerValLeuLeuMetGlyCysValAlaGluThrGlyLeu202530AlaAlaGlnProAlaMetAlaAspIleValIleThrGlnAspGluLeu354045SerAsnProValThrSerGlyGluSerValSerIleSerCysArgSer505560SerLysSerLeuLeuTyrGlnAspGlyLysThrTyrLeuAsnTrpPhe65707580LeuGlnArgProGlyGlnSerProGlnLeuLeuIleTyrLeuMetSer859095ThrArgAlaSerGlyValSerAspArgPheSerGlySerGlySerGly100105110ThrAspPheThrLeuGluIleSerArgValGluAlaGluAspValGly115120125ValTyrTyrCysGlnGlnLeuValGluTyrProLeuThrPheGlyAla130135140GlyThrLysLeuGluLeuLysArgAlaAspGlyGlyGlyGlySerGly145150155160GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuGlnGlnSer165170175GlyProGluLeuValLysProGlyAlaSerValLysIleSerCysLys180185190AlaSerGlyTyrAlaPheIleSerSerTrpMetAsnTrpValLysGln195200205ArgProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyArgIleTyrProGlyAsp210215220GlyAspThrHisTyrAsnGlyLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThr225230235240AlaAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThr245250255SerGluAspSerAlaValTyrPheCysAlaArgGluGluThrAlaGln260265270ThrGlyGlyPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSer275280285SerGluAlaSerGlyAlaAspHisGlyThrLysHisHisHisHisHis290295300His305<210>3<211>392<212>PRT<213>HRP2-9<400>3PheLeuIleLysLysCysGlyAsnAsnSerGlyAspGlyGluThrIle151015PheSerGluLysLeuAsnAsnAlaAsnIleLysCysAsnGluAsnLys202530SerThrAsnAsnLysMetLysSerSerValIleSerSerValLeuAsn354045AlaThrAsnTyrIleArgGlyCysGlnProLysIleTyrAspGlyLys505560IlePheProGlyLysGlyGlyGluLysGlnTrpIleCysLysAspThr65707580IleIleHisGlyAspThrAsnGlyAlaCysIleProProArgThrGln859095AsnLeuCysValGlyGluLeuTrpTyrLysSerTyrGlyGlyArgSer100105110AsnIleLysAsnAspThrLysGluSerLeuLysAsnLysLeuLysAsn115120125AlaIleGlnLysGluThrGluLeuLeuTyrGluTyrHisAspLysGly130135140ThrAlaIleIleSerGlnAsnAspLysLysGlyGlnLysAlaAsnAsn145150155160AsnAsnSerAsnGlyLeuProLysGlyPheCysHisAlaValGlnArg165170175SerPheIleAspTyrLysAsnMetIleLeuGlyThrSerValAsnIle180185190TyrGluTyrIleGlyLysLeuGlnGluAspIleLysLysIleIleGlu195200205LysGlyThrProGlnGlnLysAspLysThrValGlySerGlyAlaGlu210215220AsnValAsnAlaTrpTrpLysGluIleGluLysAspMetTrpAspAla225230235240ValArgCysGlyIleThrLysIleAsnLysLysLysLysAsnGlyThr245250255TyrThrGlyAspGluCysGlyIlePheProProThrGlyAsnAspGlu260265270AspGlnSerValSerTrpPheLysGluTrpGlyGluGlnPheCysIle275280285GluArgLeuGlnTyrGluGlnAsnIleArgAspAlaCysThrAsnAsn290295300GlyLysAsnGlyLysLysCysIleAsnSerLysSerGlyGlnGlyAsp305310315320LysIleGlnGlyAlaCysLysArgLysCysGluLysTyrLysLysTyr325330335IleSerGluLysLysGlnGluTrpAspLysGlnLysThrLysTyrGlu340345350AsnLysTyrValGlyLysSerAlaSerAspLeuLeuLysGluAsnTyr355360365ProGluCysIleSerAlaAsnPheAspPheIlePheAsnAspAsnIle370375380GluTyrLysThrTyrTyrProTyr385390<210>4<211>358<212>PRT<213>HRP2-9-1<400>4PheLeuIleLysGlyAspGlyGluThrIlePheSerGluLysLeuLys151015AsnAlaGluLysLysCysLysGluAsnGluSerThrAspThrAsnIle202530IleLysAsnGluLeuAspThrLysLeuSerGluProIleTyrIleArg354045GlyCysGlnSerLysArgTyrAspGlyPheIleSerProGlyLysGly505560GlyGluLysGlnGlyAlaCysIleProProArgThrGlnAsnLeuCys65707580ValGlyAsnLeuTrpAspLysSerTyrGlyGlyArgSerAsnIleLys859095AsnAspThrLysGluLeuLeuLysGluLysIleLysAsnAlaIleHis100105110LysGluThrGluLeuLeuTyrGluTyrHisAspLysGlyThrAlaIle115120125IleSerArgGlyLysGlnLysGluGlyGlyGluGluAlaAsnAsnAsn130135140SerAsnGlyLeuProLysGlyPheCysHisAlaValGlnArgSerPhe145150155160IleAspTyrLysAsnMetIleLeuGlyThrSerValSerThrTyrGlu165170175TyrIleGlyLysLeuGlnGluAspIleLysLysIleIleGluGlnGlu180185190ThrThrLysGlnAsnGlyLysThrValGlySerGlyAlaGluAsnVal195200205AsnAlaTrpTrpLysGlyIleGluLysAspMetTrpGlyAlaValLys210215220CysGlyIleLysThrIleLysLysGlnLysLysAsnGlyThrPheAsn225230235240GlyAspGluCysGlyValSerProProThrGlyAsnAspGluAspGln245250255PheValSerGluGlnAsnIleArgGluAlaCysThrIleAsnGlyLys260265270AsnGluLysLysCysIleAsnSerLysSerGlyGlnGluAspLysVal275280285GluGlyAlaCysLysArgLysCysGluLysTyrLysLysTyrIleSer290295300GluLysLysGlnGluTrpAspLysGlnLysThrLysTyrGluAsnLys305310315320TyrValGlyLysSerAlaSerAspLeuLeuLysGluAsnTyrProGlu325330335CysIleSerAlaAsnPheAspPheIlePheAsnAspLysAlaAspHis340345350LysLysTyrTyrProTyr355当前第1页1 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