一种基于石墨烯量子点检测血红蛋白的方法与流程

本发明涉及一种基于石墨烯量子点检测血红蛋白的方法。

背景技术：

血红蛋白 (Hemoglobin) 是生物界分布最广的一种蛋白质，在各种生物体内起着输氧、分解H₂O₂、产生能量和传递电子等重要作用。血红蛋白含量异常会导致多种疾病，因此，血液中血红蛋白的含量测定对临床诊断和生理研究而言意义重大。

近年来，石墨烯量子点 (石墨烯量子点) 作为一种新型荧光探针，引起多个研究领域的广泛关注。石墨烯量子点具有良好的水溶性、生物相容性好、荧光稳定性强、量子产率高等优点，这些优越的性质使石墨烯量子点荧光探针广泛应用于生化分析检测、成像分析、环境监测、药物载体等领域具有巨大的应用潜力。

目前检测血红蛋白的方法有电化学法，吸收光谱测定法，荧光分析法以及高效液相色谱法等，但现有方法存在操作步骤复杂、操作误差较大、分析时间长等缺点。与上述方法相比，基于石墨烯量子点检测血红蛋白的方法：具有较好的选择性、高灵敏度、成本低廉、操作简单、快速监测等的优点，具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于石墨烯量子点检测血红蛋白的方法。

本发明首先通过水热法制备石墨烯量子点并将其与血红蛋白作用，发现血红蛋白对石墨烯量子点的荧光淬灭作用，进而提供一种基于石墨烯量子点检测血红蛋白的新方法。

为达上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于石墨烯量子点荧光检测血红蛋白的方法，其特征在于所述的检测方法具有以下的过程和步骤：

a.将石墨烯量子点分散在磷酸盐缓冲液中得到石墨烯量子点溶液；

b.将血红蛋白溶解在磷酸盐缓冲液中得到血红蛋白溶液；

c.将步骤a和步骤b所配制的溶液充分混合后加入磷酸盐缓冲液稀释，配制一组标准溶液；其中石墨烯量子点的浓度为20mg/L，血红蛋白的浓度梯度为0～0.5μmol/L；

d.检测步骤c所配的标准溶液的荧光光谱，记录荧光强度；建立基于血红蛋白对石墨烯量子点的荧光淬灭作用的荧光淬灭程度ΔF对血红蛋白浓度的检测工作曲线；

e.将待检测样品与步骤a所配制的石墨烯量子点溶液混合，加入磷酸盐缓冲液稀释成待测溶液，检测其荧光光谱，根据荧光淬灭程度ΔF，由步骤d中得到的工作曲线，计算出待测样品中血红蛋白的含量。

上述血红蛋白的检测方法，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，其pH值为7.4。

上述的检测其荧光光谱时需在恒温25°C条件下进行荧光测定，所用的激发波长为368nm，发射波长为470nm，电压设置为500V，记录380-650nm荧光光谱数据及470nm处荧光信号。

上述的检测其荧光光谱时需在恒温25°C条件下进行荧光测定，所用的激发波长为368nm，发射波长为470nm，电压设置为500V，记录380-650nm荧光光谱数据及470nm处荧光信号。

所述方法中，石墨烯量子点可以采用现有技术中已知的方法合成，具体合成方法可参见专利：( 磺酸基石墨烯量子点生物荧光探针及其应用 201510394852.8 )。

基于血红蛋白对石墨烯量子点荧光淬灭的特性，将石墨烯量子点应用于血红蛋白的检测，建立一种基于石墨烯量子点检测红血蛋白的新方法，所述方法能够快速且灵敏高效的检测血红蛋白，而且灵敏度高，操作简单，成本低廉。

本发明方法的优点和特点如下所述：

(1)本发明的检测方法通过利用血红蛋白对石墨烯量子点的荧光淬灭现象进行检测的方

法，操作简便快捷、高效准确。

(2)本发明的检测方法，利用荧光检测具有信息量大、响应速度快、灵敏度高、光学抗干扰能力强等优点，并且可实现在实际样品中血红蛋白的快速灵敏检测，具有很好地选择性。

(3)本发明的检测方法采用的石墨烯量子点与其他量子点相比，具有水溶性好、环保无毒、荧光稳定性好、量子产率高、成本低廉等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中的石墨烯量子点荧光检测不同浓度的血红蛋白时的荧光变化值与其浓度的曲线关系图；其中，石墨烯量子点的浓度为20 mg/L，血红蛋白的浓度区间为0-10 μmol/L；F₀为空白样品的荧光强度，F_i为不同浓度的血红蛋白下石墨烯量子点的荧光强度；F_i/F₀为相对荧光强度，F₀ - F为荧光淬灭值。

图2为本发明实施例2中的石墨烯量子点荧光检测不同浓度的血红蛋白所得到的荧光光谱图；其中石墨烯量子点的浓度固定为20 mg/L，血红蛋白的浓度依次为0，0.1，0.5，1，3，5，7，9 μmol/L；FL intensity（a.u.）为相对应血红蛋白下石墨烯量子点的荧光强度，扫描波长为350-650 nm。

图3为本发明实施例2中的石墨烯量子点荧光检测不同浓度的血红蛋白时的荧光淬灭值与血红蛋白浓度的线性关系图；其中石墨烯量子点的浓度为20 mg/L，血红蛋白的浓度依次为0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmol/L；△F为荧光淬灭值 (△F= F₀-F)，F₀为空白标样（血红蛋白浓度为0μmol/L）的荧光强度，F_i为含不同浓度血红蛋白下标样的荧光强度。

图4为本发明实施例3中的石墨烯量子点荧光检测混合样品中血红蛋白的筛选效果图。图中，分别为20.9 mg/L L-精氨酸、22.0 mg/L L-赖氨酸、39.5 mg/L葡萄糖、45.3 mg/L蔗糖、44.0 mg/L维生素C、37.7 mg/L淀粉及5 mg/L的血素；F₀为空白样品（血红蛋白浓度为0μmol/L）的荧光强度，F为不同浓度成分下石墨烯量子点的荧光强度，F/F₀为相对荧光强度。

具体实施方式

现将本发明的具体实施例叙述于后。

实施例1：血红蛋白对石墨烯量子点的荧光淬灭程度与其浓度存在相关性，具体过程如下所示：

1. 配制石墨烯量子点溶液：将合成好的石墨烯量子点分散在磷酸盐缓冲液（浓度为0.01mol/L，pH值为7.4）中，得到石墨烯量子点溶液（浓度为20mg/L）；

2. 配制血红蛋白溶液：将血红蛋白充分溶解在磷酸盐缓冲液（浓度为0.01mol/L，pH值为7.4）中，得到血红蛋白溶液（浓度为0 -10μmol/L）；

3. 配制标准溶液：取一定量步骤1和步骤2所配溶液，充分混合加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.01mol/L，pH值为7.4）后，配制一组包括空白标样在内的不同已知血红蛋白浓度的标准溶液；其中石墨烯量子点终浓度为20mg/L，血红蛋白最终浓度梯度为0.05-0.5μmol/L；

4. 测定荧光光谱：通过荧光光谱仪在发波长为368nm的条件下检测步骤3)所配制的标准溶液的荧光光谱，记录380-650 nm处的荧光光谱，得到的荧光光谱图；(具体结果参见图1)，如图1所示，石墨烯量子点的荧光强度随血红蛋白溶液的浓度增加而减弱，说明血红蛋白可以明显淬灭石墨烯量子点的荧光强度。记录470nm处荧光强度；记空白标样的荧光强度为F₀，含有血红蛋白的标样的荧光强度为F_i，荧光淬灭值ΔF定义为空白标样的荧光强度F₀减去含有血红蛋白的标样的荧光强度F_i，即荧光淬灭值ΔF=F₀-F_i，相对荧光强度F_i/F₀定义为含有血红蛋白的标样的荧光强度F_i除以空白标样的荧光强度F₀；将所述的ΔF与血红蛋白的浓度C（C单位为μmol/L绘制出浓度与荧光变化值的曲线关系图；（具体结果参见图2）

如图2所示，在血红蛋白终浓度为0 -10μmol/L的范围内，荧光淬灭值△F和相对荧光强度程度F_i/F₀与血红蛋白的浓度均呈现一定的相关性。说明可以通过此量子点与血红蛋白的荧光淬灭特性，实现快速、简便、定量检测溶液中血红蛋白的含量。

实施例2：建立石墨烯量子点检测血红蛋白的工作曲线，具体过程如下所示：

依据实施例1所得结果，我们选取浓度范围为0 -0.5μmol/L的血红蛋白进行了进一步的实验。配制石墨烯量子点溶液（浓度固定为20mg/L），血红蛋白的浓度依次为0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μmol/L，将两者充分混合配制成7份标准溶液，并通过荧光光谱仪在发波长为368nm的条件下检测所述标准溶液的荧光光谱，取470 nm波长处的荧光强度值F，计算出相应的荧光淬灭值△F= F₀-F，△F与血红蛋白的浓度C存在良好的线性关系，绘制出C-△F曲线，并作为石墨烯量子点检测血红蛋白的工作曲线。(具体结果参见图3)。如图3所示，荧光淬灭值△F与血红蛋白的浓度C之间具有良好的线性关系，线性回归方程为：△F=25.885+170.8C，（C单位为μmol/L），相关系数为R²=0.995。对血红蛋白的检测限可达到1.6 nmol/L。实验表明，此石墨量子点检测血红蛋白具有方便快捷、检测限低的优点，可以用于血红蛋白的检测。

实施例3：采用本发明测定模拟实际样品中血红蛋白的含量，具体过程如下所示：

在相同实验条件下，依据市场中常见的血红蛋白补铁保健品成分，模拟一个含血红蛋白的混合体系，并分别对20.9 mg/L L-精氨酸、22.0 mg/L L-赖氨酸、39.5 mg/L 葡萄糖、45.3 mg/L 蔗糖、44.0 mg/L 维生素C、37.7 mg/L 淀粉及5 mg/L血红蛋白进行独立的荧光淬灭实验，得到相对荧光强度图谱。 (具体结果参见图4)。实验结果表明，上述成分中仅有血红蛋白使得石墨烯量子点明显淬灭；同时在混合体系下，体系的整体淬灭程度与单独的血红蛋白淬灭程度相当 (96.9 %)，这说明此石墨烯量子点探针检测血红蛋白具有灵敏性高的特点，可以用于实时检测混合溶液 (市场产品) 中的血红蛋白含量，并且在食品检测分析等领域具有较好的应用潜力。