一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法与流程

本发明属于药物分析
技术领域：
，具体来说，涉及到一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法。
背景技术：
：氨溴索(ambroxol)最早由德国学者于1976年首先研制并注册,1981年开始临床应用。氨溴索在我国临床的应用是从1991年开始的,临床疗效及安全性已得到临床证实。氨溴索为溴己新的活性代谢产物,是一种新的粘痰溶解药,能促进支气管纤毛排空运动,有利于气道分泌物排出。盐酸氨溴索自上市以来，经过多年临床应用表明，其疗效显著，毒副作用小。目前盐酸氨溴索已是市场上作用最强和最有效安全的祛痰药。国内外已有包括片剂、胶囊、口服溶液及注射剂等多种剂型产品上市，是最常用的祛痰药物之一。本品目前主要研究的杂质为反式-4-[[[(e)-2-氨基3,5-二溴苯基]亚甲基]氨基]环已醇、顺式-4-[(2-氨基3,5-二溴苄基)氨基]环已醇盐酸盐。检验条件主要是选择0.01mol/l磷酸氢二铵溶液(用磷酸调节ph值至7.0)-乙腈(50：50)作为流动相等等度洗脱方法。此类方法虽然能检测盐酸氨溴索的有关物质，但对盐酸氨溴索产品在制备、研究、检验过程中会产生工艺杂质和降解杂质等复杂成分难以达到良好的分离。盐酸氨溴索控制的杂质主要有五个(杂质a、b、c、d、e)，结构式分别为：对于工艺中和降解中产生的有关物质，在制剂中需要进行质量控制，因此，实现盐酸氨溴索与其有关物质的分离与分析，对于氨酸氨溴索注射剂的质量控制具有重要的现实意义。目前对盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法中，大部分都只检测一或两个杂质，用得都是等梯度洗脱，不能同时检测多个杂质，而且，换成常规的梯度洗脱时，容易引起基线飘移。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，其可简便，高效、全面的检测盐酸氨溴索注射剂中的杂质，各杂质之间的分离度均达到2.0以上，有效检测控制盐酸氨溴索注射剂在制备、研究、检测及存放过程中产生的五种杂质，可用于盐酸氨溴索注射剂的质量控制；并且该方法能控制基线比较平稳。本发明所述的一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，所述检测方法具体步骤如下：1)色谱柱：采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，规格4.6*250mm，填料粒径5um；2)流动相a：磷酸盐缓冲液，即取磷酸氢二铵2g溶于800ml水中，用磷酸调节ph值至4.0，再加水稀释成1000ml；流动相b：乙腈；3)检测波长：248nm；柱温：常温；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；4)梯度洗脱条件：如表1表1洗脱梯度时间(min)磷酸盐缓冲溶液(％)乙腈(％)06040155545255050405050506040本发明所述的一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，所述磷酸盐缓冲液中含质量浓度为0.02％的丁二酸。本发明所述的一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，所述检测方法中对照品溶液配制步骤具体如下：称取盐酸氨溴索对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成15mg/ml的溶液，作为对照品溶液。本发明所述的一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，所述检测方法中杂质对照品溶液配制步骤具体如下：分别称取盐酸氨溴索杂质a、b、c、d和e适量，各加甲醇溶解并稀释制成1.5ug/ml的溶液，作为杂质a、b、c、d和e对照品溶液。本发明所述的一种盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法，所述检测方法中供试品溶液配制步骤具体如下：量取盐酸氨溴索注射液适量，加甲醇稀释成0.75mg/ml的溶液，作为供试品溶液。与现有技术相比，本发明所述盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法可简便，高效、全面的检测盐酸氨溴索注射剂中的杂质，各杂质之间的分离度均达到2.0以上，有效检测控制盐酸氨溴索注射剂在制备、研究、检测及存放过程中产生的五种杂质，可用于盐酸氨溴索注射剂的质量控制。附图说明图1为盐酸氨溴索线性试验图；图2为盐酸氨溴索中杂质a线性试验图；图3为杂质b线性试验图；图4为杂质d线性试验图；图5为杂质c线性试验图；图6为杂质e线性试验图；图7为调整基线前的色谱图；图8为甲酸调整基线色谱图；图9为丁二酸调整基线色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明所述盐酸氨溴索注射剂有关物质的检测方法作进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。实施例1一、波长的选择对盐酸氨溴索及其各已知杂质的紫外光谱图进行了测定，又通过对盐酸氨溴索强制降解，以二极管检测器对各杂质峰在200-400nm范围进行扫描，结果表明盐酸氨溴索、各已知杂质以及各主要降解的未知杂质均在248nm波长处有较大吸收。二、专属性试验(一)强制降解试验(1)热破坏取本品约50ml，置具塞试管中，密封，置80℃烘箱中加热72小时，放冷，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。另取空白辅料同法操作，进行比对试验。(2)碱破坏精密量取本品5ml，置具塞试管中，加1mol/l氢氧化钠溶液3.0ml，摇匀，密封，置80℃烘箱中加热72小时，放冷，加1mol/l盐酸溶液约3.0ml中和并转移至50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，另取空白辅料同法操作，进行比对试验。(3)酸破坏精密量取本品5ml，置具塞试管中，加1mol/l盐酸溶液3.0ml，摇匀，密封，置80℃烘箱中加热72小时，放冷；加1mol/l氢氧化钠溶液约3.0ml中和并转移至50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，另取空白辅料同法操作，进行比对试验。(4)氧化破坏精密量取本品5ml，置具塞试管中，加30％双氧水溶液0.5ml，摇匀，密封，置60℃烘箱中加热24小时，放冷，加流动相转移至50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，另取空白辅料同法操作，进行比对试验。(5)光照破坏精密量取本品5ml，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，置于照度为4500lx的条件下放置3天，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，另取空白辅料同法操作，进行比对试验。(6)物料平衡计算：取盐酸氨溴索对照品适量加流动相溶解并稀释制成，摇匀作为对照品溶液，采用外标法计算上述各破坏溶液中主药的剩余含量xj％，同时对比破坏前主药的含量x0％，按百分之百主药剩余含量校正后，与以面积归一化法计算的杂质降解后主药百分比含量xz％进行对比，进行物料平衡m的计算(m＝(xj/x0)/xz*100％，结果见表2。表2强制降解试验结果由降解试验结果可知本品与降解产物能够良好分离，采用二极管阵列检测器检验上述各试验项下的主峰纯度，结果显示主峰中未检出不纯物。具体结果见以上图谱中纯度报告。通过对降解前后含量的测定，计算供试品含量下降的数值，与降解产物增加的数值，判定物料基本平衡。通过对自制样品与市售样品破坏试验图谱的观察，杂质种类、个数及大小基本相同。(二)分离度实验(1)辅料空白溶液：按处方比例配制辅料溶液分别照上述色谱条件进行试验，由图1可知本品辅料对主峰的测定无干扰。(2)对照品溶液：精密称取盐酸氨溴索对照品约15mg，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索对照品贮备液(1.5mg/ml)；另精密称取盐酸氨溴索杂质a、b、c、d、e对照品各约15mg，分别置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸氨溴索杂质a、b、c、d、e对照品贮备液(150μg/ml)。取盐酸氨溴索对照品贮备液和盐酸氨溴索杂质a、b、c、d、e对照品贮备液各1ml，分别置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为各对照品溶液；再分别取盐酸氨溴索对照品贮备液和盐酸氨溴索杂质a、b、c、d、e对照品贮备液各1ml，同置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液(每1ml含盐酸氨溴索约15μg，含杂质a、b、c、d、e1.5μg)。按上述色谱条件试验。与已知杂质的分离：由图2可知，本品主峰与杂质a、b、c、d、e均能够良好的分离。通过以上试验可证明本方法具有专属性。出峰顺序为杂质b、杂质a、盐酸氨溴索、杂质d、杂质e、杂质c。三、检出限(1)盐酸氨溴索精密量取上述分离度试验项下的盐酸氨溴索对照品溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取3ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，盐酸氨溴索的最小量为0.9ng，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的最小检出限为0.006％(2)杂质a精密量取上述分离度试验项下杂质a对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质a的最小量为1.2ng，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的最小检出限为0.008％。(3)杂质b精密量取上述分离度试验项下杂质b对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质b的最小量为0.75ng，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的最小检出限为0.005％。(4)杂质c精密量取上述分离度试验项下杂质c对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质c的最小量为3ng，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的最小检出限为0.02％。(5)杂质d精密量取上述分离度试验项下杂质d对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质d的最小量为0.6ng，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的最小检出限为0.004％。(6)杂质e精密量取上述分离度试验项下杂质e对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质e的最小量为1.5ng，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的最小检出限为0.001％。四、定量限(1)盐酸氨溴索精密量取上述分离度试验项下的盐酸氨溴索对照品溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为10，即在该色谱条件下，盐酸氨溴索的定量限浓度为0.15μg/ml，相对于供试品溶液中盐酸氨溴索的定量限为0.02％，6次试验结果的rsd为1.89％。(2)杂质a精密量取上述分离度试验项下杂质a对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质a的定量限浓度为0.15μg/ml，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的定量限为0.02％，6次试验结果的rsd为1.76％。(3)杂质b精密量取上述分离度试验项下杂质b对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质b的定量限浓度为0.15μg/ml，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的定量限为0.02％，6次试验结果的rsd为2.37％。(4)杂质c精密量取上述分离度试验项下杂质c对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质c的定量限浓度为0.38μg/ml，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的定量限为0.05％，6次试验结果的rsd为2.19％。(5)杂质d精密量取上述分离度试验项下杂质a对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质d的定量限浓度为0.15μg/ml，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的定量限为0.02％，6次试验结果的rsd为2.85％。(6)杂质e精密量取上述分离度试验项下杂质e对照品贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从图中可看出，此时信噪比(s/n)约为3，即在该色谱条件下，杂质e的定量限浓度为0.30μg/ml，相对供试品溶液(0.75mg/ml)的定量限为0.04％，6次试验结果的rsd为2.28％。五、线性与范围(1)盐酸氨溴索：精密量取上述分离度试验项下的盐酸氨溴索对照品溶液1、2、5、10、15ml，分别置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，依次精密量取5种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测定结果见表3。表3盐酸氨溴索线性关系测定结果以色谱图峰面积(a)对其浓度(c)作线性回归,得下图1。试验结果表明，盐酸氨溴索浓度在0.15～2.25μg/ml，盐酸氨溴索峰面积与浓度呈良好的线性关系。(2)杂质a、b、d：取盐酸氨溴索杂质a、b、d对照品贮备液各1、2、5、10、15ml，分别置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再各精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，依次精密量取5种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测定结果见表4。表3杂质a、b、d线性关系测定结果以色谱图峰面积(a)对其浓度(c)作线性回归,得下图2-4。试验结果表明，杂质a、b、d浓度在0.15～2.25μg/ml，其峰面积与浓度呈良好的线性关系。(2)杂质c、e：取盐酸氨溴索杂质c、e对照品贮备液各2、5、8、10、15ml，分别置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再各精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，依次精密量取5种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。测定结果见表5。表5杂质c、e线性关系测定结果以色谱图峰面积(a)对其浓度(c)作线性回归,得下图5-6。试验结果表明，杂质c、e浓度在0.30～2.25μg/ml，其峰面积与浓度呈良好的线性关系。六、已知杂质校正因子对杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e的校正因子采用标准曲线法计算。计算公式：校正因子＝主成分斜率/杂质斜率。各杂质的计算结果见表6。表6已知杂质的校正因子计算结果七、校正因子耐用性考察分别采用三台不同的液相色谱仪，三根不同的色谱柱，在相同条件下，取标准曲线溶液，测定并绘制吡拉西坦及各杂质的标准曲线，根据斜率计算各杂质的校正因子，结果见表。表6校正因子耐用性考察由于测定校正因子过程中涉及到仪器、色谱柱误差等综合因素，校正因子误差在仪器误差范围内。由表可知，杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e的校正因子较为稳定，均在1.10～1.53范围内，所以可采用加校正因子的自身对照法对这五个已知杂质进行定量。八、基线调平采用本方法进行测定时，基线往上飘，当进校量小或浓度低时，容易将量小的杂质峰给重合，积出的峰面积有较大的误差，为了改善这种情况，通过尝试在磷酸缓冲盐中加入不同的有机酸，如甲酸、乙酸、丙二酸以及丁二酸，结果发现，只有加入丁二酸时，基线才趋于平直，质量百分浓度为0.02％时，效果最好。结果见色谱图见图7和图8。当前第1页12