一种多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法与流程

本发明涉及牧草营养品质评价领域，具体涉及一种多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法。

背景技术：

多花黑麦草(Lolium multiflorum Lam.)为禾本科黑麦草属一年生或越年生牧草，适于生长在气候温暖湿润地区，是具世界栽培意义的优良牧草之一，在我国南方多省(市)均有较大面积的栽培。近年来，随着国家农业产业结构的调整，草食畜牧业快速发展，多花黑麦草因其产量高、冬春季生长旺盛、适应性强、营养价值丰富等优点，解决了我国南方冬春季家畜饲草不足的问题，在我国南方地区粮草轮作中发挥了极其重要的作用，尤其是草产量高、营养品质好的优良多花黑麦草品种对畜牧业生产尤为重要。在多花黑麦草育种工作中，不仅要培育产量高的品种，同时还要兼顾牧草的品质。

糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。可溶性糖(Water soluble carbohydrates，WSC)包括植物样品中的还原单糖以及能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。牧草中WSC的含量是影响牧草营养品质和青贮的重要因素，WSC含量高，牧草品质好，调制青贮饲料的成功率和品质也较高，反之，WSC含量低，青贮则不易成功。因此研究WSC在多花黑麦草中含量的动态变化对于饲草生产、育种具有重要指导意义。目前国内对于牧草WSC测定主要以传统湿化学方法——蒽酮硫酸比色法为主，但存在操作复杂、误差较大、成本高、耗时长、有毒有害化学药品污染环境等突出问题，难以从大量的多花黑麦草品种(系)或样品中筛选出WSC含量适当的品种(系)或样品，因此，找出一种能够快速测定多花黑麦草中WSC含量的方法，对多花黑麦草育种和牧草品质控制具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够快速测定多花黑麦草可溶性糖含量的多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法，包括以下步骤：

A、建立多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型；所述多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型采用如下方法建立，具体包括如下步骤：

a、采集多花黑麦草样品，所述多花黑麦草样品包括不同品种、不同品系、不同生育期、不同栽培方式和不同部位的鲜草样品，分别将上述采集的多花黑麦草样品进行预处理，所述预处理的方法如下所述：将采集的多花黑麦草样品先在105℃的环境中杀青20min，然后在65℃的环境中烘干后，在微型粉碎机中粉碎成粉末并过40目筛得到多花黑麦草样品粉末；

b、将步骤a得到的多花黑麦草样品粉末分别进行近红外光谱采集得到每个多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图；

c、采用PCA算法对所有多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱进行分析，剔除具有相似光谱的多花黑麦草样品，剩余的多花黑麦草样品为代表性多花黑麦草样品；

d、采用蒽酮硫酸比色法对步骤c得到的代表性多花黑麦草样品逐个进行可溶性糖含量进行测定得到每个代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值；

e、依据代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值将代表性多花黑麦草样品分为校正集和验证集两部分，具体方法如下：首先将得到的代表性多花黑麦草可溶性糖含量值从小到大进行排序，然后每隔3个取1个作为验证集，其余作为校正集，并且调整代表性多花黑麦草中可溶性糖含量的最小值和最大值，使之划归为校正集；

f、将校正集样品的近红外光谱图和校正集样品的可溶性糖含量值的导入OPUS/QUENT5.5商用光谱定量分析软件中，首先，在全谱范围内对校正集样品的近红外光谱进行预处理，接着采用偏最小二乘回归法结合交互验证对校正集样品建立预测校正模型，根据近红外定量校正模型的参数对预测校正模型进行评价，对预测校正模型进行评价的近红外定量校正模型参数包括决定系数R²、交互验证决定系数R²cv、交互验证均方根误差RMSECV，其决定系数R²为90.20％、交互验证决定系数R²cv为87.77％，交互验证均方根误差RMSECV为3.11，确定最佳光谱预处理为最小-最大归一化，最佳建模光谱区为6101.9～5446.2cm^-1和4601.5～4246.7cm^-1，最佳因子数为7，在评价过程中根据马氏距离、主因素分析图、光谱残差图以及化学分析值残差图结果剔除异常的多花黑麦草校正集样品，从而得到最佳的多花黑麦草可溶性糖含量最佳近红外预测校正模型；接着，将验证集样品的近红外光谱和验证集样品的可溶性糖含量导入建立的预测校正模型中进行分析验证得到预测验证模型；接着，利用近红外定量验证模型的参数对所得的预测验证模型进行评价，对预测验证模型进行评价的近红外定量验证模型的参数包括外部验证决定系数R²ev和验证均方根误差RMSEP，其外部验证决定系数R²ev为91.28％，验证均方根误差RMSEP为2.56，在评价过程中根据马氏距离、主因素分析图、光谱残差图以及化学分析值残差图结果剔除异常的多花黑麦草验证集样品，从而得到最佳多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型；

B、将待测的多花黑麦草样品按照步骤a所述的预处理方法处理后得到待测多花黑麦草样品粉末；

C、将步骤B得到的待测多花黑麦草样品粉末进行近红外光谱采集得到待测多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图；

D、将待测多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图和步骤f中得到的多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型导入到OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件中，通过模型运算分析，即可得到待测多花黑麦草样品中可溶性糖的含量。

进一步的是，所述多花黑麦草的生育期包括分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期、结实期、成熟期。

进一步的是，所述多花黑麦草的栽培方式包括撒播栽培方式、育苗移栽栽培方式、施用氮肥栽培方式。

进一步的是，所述多花黑麦草的采集部位包括茎、叶、全株。

进一步的是，在步骤b中，采用如下所述的方法对多花黑麦草样品粉末分别进行近红外光谱采集，具体的，取适量多花黑麦草样品粉末，放入Bruker MPA型傅里叶变换NIRS仪样品杯中，使样品自然摊平，设定仪器工作参数，在温度为25±0.5℃条件下采集样品近红外光谱，得到该样品的第一次近红外光谱值，接着，将样品杯中的样品取出后再放入样品杯中，使样品自然摊平，再次采集样品近红外光谱，得到该样品的第二次近红外光谱值，然后对第一次近红外光谱值和第二次近红外光谱值进行平均，得到该多花黑麦草样品的近红外原始光谱图。

进一步的是，所述Bruker MPA型傅里叶变换NIRS仪器工作参数设定为：谱区范围4000～12500cm^-1，分辨率8cm^-1，扫描次数64次。

进一步的是，采用OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件对第一次近红外光谱值和第二次近红外光谱值进行平均，得到多花黑麦草样品的近红外原始光谱图。

进一步的是，在步骤d中，采用蒽酮硫酸比色法的代表性多花黑麦草样品逐个进行可溶性糖含量进行测定得到每个代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值；

进一步的是，在步骤f中，在全谱范围内对校正集样品的近红外光谱采用一阶导数、二阶导数、减去一条直线、一阶导数+MSC(多元散射校正)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化、没有光谱预处理、最小-最大归一化、矢量归一化、消除常量偏移量和多元散射校正11种光谱预处理方法。

本发明的有益效果在于：本发明所述的多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法提供了一种基于近红外光谱技术的多花黑麦草中可溶性糖真实含量的预测模型，在已知大量样品真实含量的基础上，采集样品的近红外原始光谱，建立基于近红外光谱技术和化学计量学方法的多花黑麦草可溶性糖含量的定量分析预测模型，接着，只需要将待测的多花黑麦草样品经过预处理后得到待测多花黑麦草样品粉末；并采集其近红外原始光谱图，光谱采集过程时间短，在采集近红外光谱后就可以进行检测，除前期建立预测模型外，整个近红外检测过程仅需短短的几分钟，具有操作简单、检测迅速、检测效率高的特点，而且该方法是在在已知大量样品真实含量的基础上，采集样品的近红外原始光谱，建立基于近红外光谱技术和化学计量学方法的多花黑麦草可溶性糖含量的定量分析预测模型，其检测精度非常高，此外，本发明的检测方法不需要加入任何有机试剂，不会损害检测人员的健康，更不会因使用化学试剂导致环境污染等问题，更加安全环保，对于多花黑麦草生产和育种工作具有极为重要的意义。

附图说明

图1是实施例中所述404份多花黑麦草样品的近红外光谱图；

图2是实施例中所述123份代表性多花黑麦草样品的近红外光谱图；

图3是实施例中校正集样品的近红外光谱在最佳预处理方式最小-最大归一化进行预处理后最佳建模谱区的近红外光谱图；

图4是实施例中交叉验证均方根误差RMSECV、交互验证决定系数R²_cv随着主成份维数的变化图；

图5是实施例中验证集样品可溶性糖含量化学值与近红外光谱预测值之间的相关性图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

该多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法，包括以下步骤：

A、建立多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型；所述多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型采用如下方法建立，具体包括如下步骤：

a、采集多花黑麦草样品，所述多花黑麦草样品包括不同品种、不同品系、不同生育期、不同栽培方式和不同部位的鲜草样品，分别将上述采集的多花黑麦草样品进行预处理，所述预处理的方法如下所述：将采集的多花黑麦草样品先在105℃的环境中杀青20min，然后在65℃的环境中烘干后，在微型粉碎机中粉碎成粉末并过40目筛得到多花黑麦草样品粉末；

b、将步骤a得到的多花黑麦草样品粉末分别进行近红外光谱采集得到每个多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图；

c、采用PCA算法对所有多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱进行分析，剔除具有相似光谱的多花黑麦草样品，剩余的多花黑麦草样品为代表性多花黑麦草样品；

d、采用蒽酮硫酸比色法对步骤c得到的代表性多花黑麦草样品逐个进行可溶性糖含量进行测定得到每个代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值；

e、依据代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值将代表性多花黑麦草样品分为校正集和验证集两部分，具体方法如下：首先将得到的代表性多花黑麦草可溶性糖含量值从小到大进行排序，然后每隔3个取1个作为验证集，其余作为校正集，并且调整代表性多花黑麦草中可溶性糖含量的最小值和最大值，使之划归为校正集；

f、将校正集样品的近红外光谱图和校正集样品的可溶性糖含量值的导入OPUS/QUENT5.5商用光谱定量分析软件中，首先，在全谱范围内对校正集样品的近红外光谱进行预处理，接着采用偏最小二乘回归法结合交互验证对校正集样品建立预测校正模型，根据近红外定量校正模型的参数对预测校正模型进行评价，对预测校正模型进行评价的近红外定量校正模型参数包括决定系数R²、交互验证决定系数R²cv、交互验证均方根误差RMSECV，其决定系数R²为90.20％、交互验证决定系数R²cv为87.77％，交互验证均方根误差RMSECV为3.11，确定最佳光谱预处理为最小-最大归一化，最佳建模光谱区为6101.9～5446.2cm^-1和4601.5～4246.7cm^-1，最佳因子数为7，在评价过程中根据马氏距离、主因素分析图、光谱残差图以及化学分析值残差图结果剔除异常的多花黑麦草校正集样品，从而得到最佳的多花黑麦草可溶性糖含量最佳近红外预测校正模型；接着，将验证集样品的近红外光谱和验证集样品的可溶性糖含量导入建立的预测校正模型中进行分析验证得到预测验证模型；接着，利用近红外定量验证模型的参数对所得的预测验证模型进行评价，对预测验证模型进行评价的近红外定量验证模型的参数包括外部验证决定系数R²ev和验证均方根误差RMSEP，其外部验证决定系数R²ev为91.28％，验证均方根误差RMSEP为2.56，在评价过程中根据马氏距离、主因素分析图、光谱残差图以及化学分析值残差图结果剔除异常的多花黑麦草验证集样品，从而得到最佳多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型；

B、将待测的多花黑麦草样品按照步骤a所述的预处理方法处理后得到待测多花黑麦草样品粉末；

C、将步骤B得到的待测多花黑麦草样品粉末进行近红外光谱采集得到待测多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图；

D、将待测多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图和步骤f中得到的多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型导入到OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件中，通过模型运算分析，即可得到待测多花黑麦草样品中可溶性糖的含量。

本发明所述的多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法提供了一种基于近红外光谱技术的多花黑麦草中可溶性糖真实含量的预测模型，在已知大量样品真实含量的基础上，采集样品的近红外原始光谱，建立基于近红外光谱技术和化学计量学方法的多花黑麦草可溶性糖含量的定量分析预测模型，接着，只需要将待测的多花黑麦草样品经过预处理后得到待测多花黑麦草样品粉末；并采集其近红外原始光谱图，光谱采集过程时间短，在采集近红外光谱后就可以进行检测，除前期建立预测模型外，整个近红外检测过程仅需短短的几分钟，具有操作简单、检测迅速、检测效率高的特点，而且该方法是在在已知大量样品真实含量的基础上，采集样品的近红外原始光谱，建立基于近红外光谱技术和化学计量学方法的多花黑麦草可溶性糖含量的定量分析预测模型，其检测精度非常高，此外，本发明的检测方法不需要加入任何有机试剂，不会损害检测人员的健康，更不会因使用化学试剂导致环境污染等问题，更加安全环保，对于多花黑麦草生产和育种工作具有极为重要的意义。

预测模型的检测精度与采集样品的种类有直接的关系，为了进一步增加预测模型的检测精度，需采集不同生育期的多花黑麦草样品，所述多花黑麦草的生育期包括分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期、结实期、成熟期。

进一步的是，预测模型的检测精度与采集样品的种类有直接的关系，为了进一步增加预测模型的检测精度，需采集不同栽培方式的多花黑麦草样品，所述多花黑麦草的栽培方式包括撒播栽培方式、育苗移栽栽培方式、施用氮肥栽培方式。

进一步的是，预测模型的检测精度与采集样品的种类有直接的关系，为了进一步增加预测模型的检测精度，需采集不同部位的多花黑麦草样品，所述多花黑麦草的采集部位包括茎、叶、全株。

为了使得到的多花黑麦草样品的近红外原始光谱图更加准确真实，在步骤b中，采用如下所述的方法对多花黑麦草样品粉末分别进行近红外光谱采集，具体的，取适量多花黑麦草样品粉末，放入MPA型傅里叶变换NIRS仪样品杯中，使样品自然摊平，设定仪器工作参数，采集样品近红外光谱，得到该样品的第一次近红外光谱值，接着，将样品杯中的样品取出后再放入样品杯中，使样品自然摊平，再次采集样品近红外光谱，得到该样品的第二次近红外光谱值，然后对第一次近红外光谱值和第二次近红外光谱值进行平均，得到该多花黑麦草样品的近红外原始光谱图。

进一步的是，所述Bruker MPA型傅里叶变换NIRS仪器工作参数设定为：谱区范围4000～12000cm^-1，分辨率8cm^-1，扫描次数64次。

为了方便操作，采用OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件对第一次近红外光谱值和第二次近红外光谱值进行平均，得到多花黑麦草样品的近红外原始光谱图。

进一步的是，在步骤d中，采用蒽酮硫酸比色法的代表性多花黑麦草样品逐个进行可溶性糖含量进行测定得到每个代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值；

进一步的是，在步骤f中，在全谱范围内对校正集样品的近红外光谱采用一阶导数、二阶导数、减去一条直线、一阶导数+MSC(多元散射校正)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化、没有光谱预处理、最小-最大归一化、矢量归一化、消除常量偏移量和多元散射校正11种光谱预处理方法。

实施例

A、建立多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型；所述多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型采用如下方法建立，具体包括如下步骤：

a、采集多花黑麦草样品，所述多花黑麦草样品为2015-2016年采集的多花黑麦草样品，包括16个国审品种，22个新品系，采集生育期包括分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期、结实期、成熟期七个生育期，采集部位包括茎、叶、全株，采集多花黑麦草的栽培方式包括撒播栽培方式、育苗移栽栽培方式、施用氮肥栽培方式，多花黑麦草样品一共403份，在105℃杀青20min，65℃烘干后，在微型粉碎机中粉碎成粉末并过40目筛，得到多花黑麦草样品粉末；

b、将步骤a得到的多花黑麦草样品粉末分别进行近红外光谱采集得到每个多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图；具体的，取适量多花黑麦草样品粉末，放入Bruker公司生产的MPA型傅里叶变换NIRS仪样品杯中，使样品自然摊平，装载样品时，尽量保持样品的装载量、实密程度和表面平整一致，样品装载量为样品杯容量的一半左右，设定仪器工作参数为谱区范围4000～12500cm^-1，分辨率8cm^-1，扫描次数64次，以仪器内置参比作为校正采集样品光谱；在室温25±0.5℃条件下进行光谱采集，得到该样品的第一次近红外光谱值，接着，将样品杯中的样品取出后再放入样品杯中，使样品自然摊平，再次采集样品近红外光谱，得到该样品的第二次近红外光谱值，采集两次是为了减少取样引起的光谱漂移，然后采用OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件对第一次近红外光谱值和第二次近红外光谱值进行平均，得到多花黑麦草样品的近红外原始光谱图，样品原始光谱图如图1所示；

c、将步骤b中得到的原始光谱图导入德国Bruker公司的OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件中，采用PCA算法对所有多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱进行分析，剔除具有相似光谱的多花黑麦草样品，剩余123份多花黑麦草样品为代表性多花黑麦草样品，其样品原始光谱图如图2所示；

d、采用蒽酮硫酸比色法对步骤c得到的代表性多花黑麦草样品逐个进行可溶性糖含量进行测定得到每个代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值；

所述的蒽酮硫酸比色法为：利用苏州科铭《植物可溶性糖试剂盒——微量法》进行测定，所用仪器为Thermo scientific公司生产的Multiskan^TM Go酶标仪，其步骤如下：

1、样品中可溶性糖的提取：称取0.035～0.050g样品粉末于2.0mL离心管中，加入1mL蒸馏水在高通量组织研磨仪中研磨成匀浆，95℃水浴10min(在此过程中，保持离心管盖盖紧，以防止水分散失)，冷却后，在25℃条件下，8000g离心10min，取上清液于10mL离心管中，用蒸馏水定容至10mL，摇匀备用；

2、可溶性糖含量测定：在测定前酶标仪预热30min，调节波长至620nm；将试剂盒中的试剂一加入2.5mL试剂二配置为工作液，充分溶解后使用，较难溶解可加热搅拌；将样品和试剂加入1.5mL离心管进行反应，测定管中加入40μL样品、40μL蒸馏水、20μL工作液和200μL浓硫酸，空白管中以等体积的蒸馏水代替样品；将上述混合液混匀，置于95℃水浴10min(盖紧盖子，以防止水分散失)，冷却至室温后，取200μL转移至96孔酶标板中，于620nm处，分别读取空白管和测定管的吸光度值；注意若△A大于1(△A＝A测定管-A空白管)，需要将样品用蒸馏水稀释，同时，计算公式中乘以相应的稀释倍数；

3、可溶性糖含量的计算：按照公式——可溶性糖(％)＝[(△A+0.07)+4.275×V1]÷(W×V1-V2)÷1000×100＝2.34×(△A+0.07)÷W÷10。其中，V1为加入样品体积，40μL；V2为加入提取液体积，10mL；W为样品干重g；

e、依据代表性多花黑麦草样品可溶性糖含量值将代表性多花黑麦草样品分为校正集和验证集两部分，具体方法如下：首先将得到的代表性多花黑麦草可溶性糖含量值从小到大进行排序，然后每隔3个取1个作为验证集，其余作为校正集；即具有代表性的123份多花黑麦草样品中，有93份作为校正集，30份作为验证集，并且调整多花黑麦草中可溶性糖含量的最小值和最大值，使之划归为校正集。

f、将校正集样品的近红外光谱图和校正集样品的可溶性糖含量值的导入OPUS/QUENT5.5商用光谱定量分析软件中，首先，在全谱范围内对校正集样品的近红外光谱进行预处理，在全谱范围内对校正集样品的近红外光谱采用一阶导数、二阶导数、减去一条直线、一阶导数+MSC(多元散射校正)、一阶导数+减去一条直线、一阶导数+矢量归一化、没有光谱预处理、最小-最大归一化、矢量归一化、消除常量偏移量和多元散射校正11种光谱预处理方法，接着采用偏最小二乘回归法结合交互验证对校正集样品建立预测校正模型，根据近红外定量校正模型的参数对预测校正模型进行评价，确定最佳光谱预处理方法，主成份因子数和最佳建模光谱区，最终以预测校正模型的交互验证均方根误差RMSECV的最小值对应最佳光谱预处理方法、最佳建模光谱区和最佳主成份因子数，图3是校正集样品的近红外光谱在最佳预处理方式最小-最大归一化进行预处理后最佳建模谱区的近红外光谱图；表1是不同光谱预处理方法下最佳建模谱区和模型参数，由表1所述，最终确定的最佳光谱预处理为最小-最大归一化，最佳建模光谱区为6101.9～5446.2cm^-1和4601.5～4246.7cm^-1，最佳因子数为7；在评价过程中根据马氏距离、主因素分析图、光谱残差图以及化学分析值残差图等结果剔除异常的多花黑麦草校正集样品，从而得到最佳的多花黑麦草可溶性糖含量最佳近红外预测校正模型，对预测校正模型进行评价的近红外定量校正模型参数包括决定系数R²、交互验证决定系数R²cv、交互验证均方根误差RMSECV；接着，采用验证集样品对预测校正模型进行外部验证，所述的外部验证的具体方法是利用预测校正模型对验证集光谱进行预测，即在德国Bruker公司的OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件中选择建立定量2方法，将验证集样品的近红外光谱和验证集样品的可溶性糖含量导入建立的预测校正模型中进行分析验证得到预测验证模型；接着，利用近红外定量验证模型的参数对所得的预测验证模型进行评价，在评价过程中根据马氏距离、主因素分析图、光谱残差图以及化学分析值残差图等结果剔除异常的多花黑麦草验证集样品，从而得到最佳多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型；对预测验证模型进行评价的近红外定量验证模型参数包括外部验证决定系数R²ev和验证均方根误差RMSEP。即预测校正模型有较高的决定系数R²、交互验证决定系数R²cv和较低的RMSECV，预测验证模型有较高的外部验证决定系数R²ev和较低的RMSEP值时，所述近红外预测模型适用于多花黑麦草可溶性糖含量的测定；图4是交叉验证均方根误差RMSECV、交互验证决定系数R²cv随着主成份维数的变化图，图5是验证集样品可溶性糖含量化学值与近红外光谱预测值之间的相关性图；通过优化评价，所述的最优的多花黑麦草可溶性糖含量的预测模型，其决定系数R²为90.20％、交互验证决定系数R²cv为87.77％、外部验证决定系数R²ev为91.28％、RMSECV为3.11和RMSEP为2.56；所述预测校正模型剔除了4个异常样品，即校正集样品为89个；所述的预测验证模型没有异常样品，即验证集样品为30个；

表1

B、将待测的多花黑麦草样品按照步骤a所述的预处理方法处理后得到待测多花黑麦草样品粉末；

C、将步骤B得到的待测多花黑麦草样品粉末进行近红外光谱采集得到待测多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图；

D、将待测多花黑麦草样品粉末的近红外原始光谱图和步骤f中得到的多花黑麦草可溶性糖含量近红外预测模型导入到OPUS/QUENT 5.5商用光谱定量分析软件中，通过模型运算分析，即可得到待测多花黑麦草样品中可溶性糖的含量。

下表为待测的38份多花黑麦草样品采用上述方法测得的可溶性糖的含量值；

由上表可知，采用本发明所述的多花黑麦草可溶性糖含量的测定方法测定的多花黑麦草可溶性糖含量的测定值与其真实值非常接近，其检测精度非常高。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可以利用上述的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的变动和修饰，均属于本发明技术方案保护的范围内。