一种可视化金纳米粒子探针的制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米探针领域，具体涉及一种可视化顺序检测腺苷和三价铬离子的金纳米粒子探针的制备方法，以及所制备的探针在检测腺苷和三价铬离子中的应用。

背景技术：

金纳米粒子具有独特的光学和电学性质，被广泛地应用于分析检测和生物医学等领域。通过改变尺寸和形状能够可控地调节金纳米粒子的局域表面等离子体共振吸收峰，使其溶液呈现出不同颜色，仅裸眼即可辨别。自1996年mirkin等首次构筑了脱氧核糖核酸(dna)、金纳米粒子(aunps)生物纳米复合体系以来，近年利用aunps作为光学生物传感器已成为研究热点(c.a.mirkin,r.l.letsinger,r.c.mucicandj.j.storhoff,nature,1996,382,607-609.)。

如2006年liu等开发的一种典型的检测铅离子的方法是将两种dna修饰到aunps表面上，利用碱基互补配对原理用适配体将纳米粒子连接起来，从而使aunps聚集，溶液颜色为蓝色。加入待检测配体后，由于配体与适配体的特异性结合，使适配体从aunps表面脱落，进而使聚集的aunps解聚，溶液变为红色(j.w.liuandy.lu,angew.chem.int.ed.,2006,45,90-94.)。这种将aunps独特的光学性质和适配体特异性结合配体的性质结合起来发展的可视化检测方法已经拓展到了其它检测领域，如对金属离子、dna、蛋白质、细胞等的检测。然而以liu等为代表发展的一系列金纳米粒子可视化检测方法只能单一的检测一种物质，因此为了最大限度地提升aunps可视化探针溶液的利用率，开发一种能够实现双重可视化检测的新方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种可视化顺序检测腺苷和三价铬离子的金纳米粒子探针的制备方法，该方法操作简单，反应条件温和，所得金纳米粒子探针粒径均匀，分散性好，能用于实际生物样品中腺苷和三价铬离子的检测。

为实现上述目的，本发明提供的一种可视化顺序检测腺苷和三价铬离子的金纳米粒子探针的制备方法，步骤包括：

(1)将50-150ml1-3mm氯金酸溶液加入带有回流装置的烧瓶中，搅拌，加热到沸腾，然后快速加入5-15ml35-40mm柠檬酸钠溶液，回流直到溶液变为酒红色。将烧瓶移出热源，继续搅拌，冷却至室温，0-5℃下保存备用；

(2)将100-200μm5-10μl巯基dna1和dna2与tcep按照物质的量的比为1:20-1:80混合均匀，室温放置0.5-2小时。所述的dna1和dna2的序列分别是：

5’-cccaggtaaaaaaaaaa-hs-3’

5’-hs-aaaaaaaaaaaccttcc-3’

(3)分别取步骤(1)得到的金纳米粒子溶液500-1000μl于两个玻璃管中，分别加入步骤(2)处理得到的dna1、dna2和100-200μm5-10μlmua，加入二次水使溶液最终体积为1-2ml，混匀，将两个玻璃管中的溶液置于暗室15-20小时；

(4)向步骤(3)得到的两个玻璃管中的溶液各加1-2mtris-hcl(ph7.0-7.5)缓冲液5-10μl和1-2mnacl溶液50-100μl，轻轻震荡摇匀并置于暗室过夜；

(5)向步骤(4)得到的两个玻璃管中的溶液各加1-2mtris-hcl(ph7.0-7.5)缓冲液1-5μl和1-2mnacl溶液10-50μl，轻轻震荡摇匀并置于暗室过夜；

(6)分别取步骤(5)得到的两个玻璃管中的溶液各200-1000μl于两个1.5ml离心管中，置于台式离心机中以10000-15000rpm的转速离心10-20分钟，尽可能多的去掉上清液以除去游离在溶液中的dna。加入200-1000μl含100-200mmnacl，15-25mmtris-hclph7.0-7.5的缓冲液使金纳米粒子重新分散；

(7)将步骤(6)得到的两种溶液混合均匀，加入1-2μl100-200μm的腺苷适配体，使适配体与dna的比例为0.2-1.0；

(8)将步骤(7)得到的溶液在50-70℃下反应5-20分钟，缓慢冷却至室温，并在2-7℃下保存。

步骤(1)中氯金酸和柠檬酸钠的浓度分别优选为1mm和38.8mm，保存温度优选为4℃；

步骤(2)中巯基dna1和巯基dna2的浓度和体积优选为100μm6.6μl，室温放置时间优选为1小时；

步骤(3)中金纳米粒子溶液体积优选为600μl，mua的浓度和体积优选为100μm6.6μl，最终体积优选为1ml，置于暗室时间优选为16小时；

步骤(4)中优选1mph7.5的tris-hcl缓冲液8.4μl和1mnacl溶液76μl；

步骤(5)中优选1mph7.5的tris-hcl缓冲液4.2μl和1mnacl溶液42μl；

步骤(6)优选溶液体积为500μl，置于台式离心机中以13000rpm的转速离心15分钟。加入500μl含1500mmnacl，20mmtris-hclph7.0的缓冲液使金纳米粒子重新分散；

步骤(7)中优选腺苷适配体的体积和浓度分别是1.75μl100μm，适配体与dna的比例为0.6；

步骤(8)中优选反应温度为65℃，反应时间为15分钟。

本发明方法制备的可视化纳米探针可用于检测实际生物样品中的腺苷和cr³⁺。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供的可视化探针可以双重顺序检测腺苷和cr³⁺，实现“一体两用”；

(2)本发明提供的可视化检测探针灵敏度高、选择性好，对腺苷和cr³⁺的检出限分别为1.8×10^-8m、1.7×10^-11m，比现有方法的检出限低至少一个数量级；

(3)不需要大型仪器，通过裸眼观察或比色光谱，即可识别检测结果；

(4)本发明所用试剂和操作过程均无毒副作用；

(5)本发明方法简单、快速、易操作，可进行现场原位快速检测。

(6)

附图说明

图1为本发明制备的可视化纳米探针的作用机理示意图

图2为本发明制备的可视化纳米探针溶液随孵育温度、时间的变化其uv-vis吸收光谱比值a522/a650的变化

图3为本发明制备的可视化纳米探针溶液随腺苷浓度的变化其uv-vis吸收光谱的变化

图4为本发明制备的可视化纳米探针溶液与不同浓度腺苷溶液之间的线性关系

图5为本发明制备的可视化纳米探针溶液随cr³⁺浓度的变化其uv-vis吸收光谱的变化

图6为本发明制备的可视化纳米探针溶液与不同浓度cr³⁺溶液之间的线性关系

具体实施方式

本发明是以经典的柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备得到金纳米粒子溶液，通过au-s化学键将巯基修饰dna和11-巯基十一烷酸(mua)共同功能化在金纳米粒子表面。利用核酸碱基互补配对原理将腺苷适配体与修饰在金纳米粒子表面上的dna互补配对，使金纳米粒子同时具有适配体的特异性识别腺苷的能力和mua的络合cr³⁺的能力，并用于实际生物样品中腺苷和cr³⁺的检测。下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

可视化金纳米粒子探针的制备：

(1)将100ml1mm氯金酸溶液加入带有回流装置的烧瓶中，搅拌，加热到沸腾，然后快速加入10ml38.8mm柠檬酸钠溶液，回流直到溶液变为酒红色。将烧瓶移出热源，继续搅拌，冷却至室温，4℃下保存备用；

(2)将100μm6.6μl巯基dna1和dna2与tcep按照物质的量比为1:50的比例混合均匀，室温放置1小时；

(3)分别取步骤(1)得到的金纳米粒子溶液600μl于两个玻璃管中，分别加入步骤(2)处理得到的dna1、dna2和100μm6.6μlmua，加入二次水使溶液最终体积为1ml，混匀，将两个玻璃管中的溶液置于暗室16小时；

(4)向步骤(3)得到的两个玻璃管中的溶液各加1mtris-hcl(ph7.5)缓冲液8.4μl和1mnacl溶液76μl，轻轻震荡摇匀并置于暗室过夜；

(5)向步骤(4)得到的两个玻璃管中的溶液各加1mtris-hcl(ph7.5)缓冲液4.2μl和1mnacl溶液42μl，轻轻震荡摇匀并置于暗室过夜；

(6)分别取步骤(5)得到的两个玻璃管中的溶液各500μl于两个1.5ml离心管中，置于台式离心机中以13000rpm的转速离心15分钟，尽可能多的去掉上清液以除去游离在溶液中的dna。加入500μl含150mmnacl，20mmtris-hclph7.0的缓冲液使金纳米粒子重新分散；

(7)将步骤(6)得到的两种溶液混合均匀，加入1.75μl100μm的腺苷适配体，使适配体与dna的比例为0.6；

(8)将步骤(7)得到的溶液在65℃下反应15分钟，缓慢冷却至室温，并在4℃下保存。

制备的可视化纳米探针的作用机理示意图见图1。

实施例2

孵育时间和温度对腺苷与实施例1制备的可视化纳米探针溶液反应的影响：

取500μl实施例1制备的可视化纳米探针溶液，向其中加入150μl0.01m腺苷，2×10^-3mmgcl2，加二次水使最终溶液体积达到750μl。将溶液分别在25，30，35，40，45℃下反应2，4，6，8，10，12，14分钟，检测不同温度不同时间下对uv-vis吸收光谱比值a522/a650的影响。

不同温度不同时间对可视化纳米探针溶液uv-vis吸收光谱比值a522/a650的影响见图2：在不同反应时间下，吸收光谱比值a522/a650均为常数；随着温度不断升高，常数数值不断降低，说明本发明制备的可视化纳米探针溶液与腺苷反应非常迅速(小于2分钟)且在室温下(25℃)即可完成反应。

实施例3

向实施例1制备的可视化纳米探针溶液中加入不同浓度的腺苷溶液uv-vis吸收谱图随腺苷浓度的变化实验：

各取实施例1制备的可视化纳米探针溶液80μl于0.5ml离心管中，分别向其中加入不同浓度的腺苷和2×10^-3mmgcl2溶液，加入二次水使最终溶液体积为120μl。检测在不同腺苷浓度下，可视化纳米探针溶液的uv-vis吸收光谱的变化。

不同浓度的腺苷溶液对可视化纳米探针溶液的uv-vis吸收光谱的影响见图3：逐渐增加腺苷的浓度，可视化纳米探针溶液在522nm处的吸收峰逐渐升高，650nm处的吸收峰逐渐降低。说明本发明制备的可视化纳米探针溶液能够实现对不同腺苷浓度的检测。

此外，本发明制备的可视化纳米探针溶液的uv-vis吸收光谱比值a522/a650的变化与不同浓度腺苷溶液呈线性关系，如图4所示，随着腺苷浓度的增长，吸收光谱比值a522/a650逐渐增强，线性方程的r²＝0.994。

实施例4

向实施例1制备的可视化纳米探针溶液中加入不同浓度的cr³⁺溶液uv-vis吸收谱图随腺苷浓度的变化实验：

取实施例1制备的可视化纳米探针溶液200μl，向其中加入腺苷溶液，使其浓度10^-4m，加入为mgcl2溶液，使其浓度为2×10^-3m，加入二次水使最终溶液体积为450μl。逐渐向溶液中加入cr³⁺，检测在不同cr³⁺浓度下，可视化纳米探针溶液的uv-vis吸收光谱的变化。

不同浓度的cr³⁺溶液对可视化纳米探针溶液的uv-vis吸收光谱的影响见图5：逐渐增加cr³⁺的浓度，可视化纳米探针溶液在522nm处的吸收峰逐渐降低，650nm处的吸收峰逐渐升高。说明本发明制备的可视化纳米探针溶液能够实现对不同cr³⁺浓度的检测。

此外，本发明制备的可视化纳米探针溶液的uv-vis吸收光谱比值a650/a522的变化与不同浓度cr³⁺溶液呈线性关系，如图6所示，随着cr³⁺浓度的增长，吸收光谱比值a650/a522逐渐增强，线性方程的r²＝0.991。

实施例5

实施例1制备的可视化纳米探针溶液用于实际生物样品中腺苷和cr³⁺的检测实验：

如表1和表2所示，采用标准加入法，向处理过的人体尿液中顺序加入腺苷和cr³⁺。用实施例1制备的可视化纳米探针溶液检测腺苷和cr³⁺的含量，测得的相对标准偏差均小于5％，说明本发明制备的可视化纳米探针可以用于检测实际生物样品中的腺苷和cr³⁺。

表1为本发明制备的可视化纳米探针溶液用于实际生物样品中腺苷的检测

表2为本发明制备的可视化纳米探针溶液用于实际生物样品中cr³⁺的检测