本发明涉及药物分析领域，具体涉及的是一种阿普斯特片有效成分的含量测定方法。
背景技术：
阿普斯特(Apremilast)是一种小分子磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制剂，由Celgene生物技术公司开发，于2014年3月经美国FDA批准上市用于治疗银屑病关节炎，其化学名称为N-[2-[(1S)-1-(3ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-(methylsulfonyl)ethyl]-2,3-dihydro-1,3-dioxo-1H-isoindol-4-yl]acetamide，分子式C22H24N2O7S，相对分子质量为460.5。化学结构式如下：
阿普斯特片是继托法替尼后又一治疗关节炎的重磅药物，也是第一个获批的的磷酸二酯酶抑制剂，销售前景极为广阔。然而现有技术中，少有报道阿普斯特的含量测定方法。而作为医药制剂，严格控制其出厂时的含量非常必要的。为了准确地控制阿普斯特片的质量，本发明提供一种能简单、快速、准确测出阿普斯特含量的测定方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种阿普斯特片有效成分的含量测定方法，该测定方法便捷、准确、可靠，能够实现对阿普斯特产品质量的有效控制。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种阿普斯特片有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取阿普斯特对照品适量，用稀释剂溶解；
(2)供试品溶液的制备：取样品阿普斯特片适量，用稀释剂溶解，超声，过滤，取滤液置于容量瓶中备用；
(3)高效液相色谱条件：C18色谱柱：4.6mm×250mm、5μm，流动相为2,4-二甲基-3-戊醇—2-甲基-2-己醇—10mmol/L 3-甲基丁酸铵，检测波长为242nm；流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL；
(4)测定法：分别精密吸取对照品及供试品溶液注入液相色谱仪，测定。
步骤(1)中，采用2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的所述稀释剂，将所述阿普斯特对照品制成浓度为20ug/mL的对照品溶液。
步骤(2)中，先将20片所述阿普斯特片研细并置于50mL容量瓶中，加入2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的稀释剂振摇溶解，超声5min，过滤，滤液放冷至室温，然后加流动相2,4-二甲基-3-戊醇—2-甲基-2-己醇—10mmol/L 3-甲基丁酸铵稀释至刻度，摇匀混合液，精密量取1mL混合液置10mL容量瓶中，最后用上述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述供试品溶液。
步骤(3)中，所述流动相的pH值为5.0～7.0，优选地，pH值为6.2，所述流动相2,4-二甲基-3-戊醇：2-甲基-2-己醇：10mM 3-甲基丁酸铵＝35：60：5。本发明中优选的pH值能够使阿普斯特片中各色谱峰有很好的分离，改善峰拖尾现象。
本发明最佳的一种阿普斯特片有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取阿普斯特对照品适量，加入2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的稀释剂，制成每l ml含阿普斯特20μg的溶液，作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取样品阿普斯特片20片(约相当于阿普斯特10mg)，置研钵中研细过四号筛，精密称定，置20mL容量瓶中，加入2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的稀释剂振摇使溶解，超声5min，过滤，滤液放冷至室温，加流动相(2,4-二甲基-3-戊醇：2-甲基-2-己醇：10mmol/L 3-甲基丁酸铵＝35：60：5)稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置10mL容量瓶中，用上述稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
(3)高效液相色谱条件：
色谱柱：OJ-RH C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：2,4-二甲基-3-戊醇：2-甲基-2-己醇：10mmol/L 3-甲基丁酸铵＝35：60：5；检测波长：242nm；流速:1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；理论板数按阿普斯特峰计算应不小于6000；进样方式：自动进样；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
采用上述技术方案后，本发明一种阿普斯特片有效成分的含量测定方法，能够便捷、准确、可靠地测定出阿普斯特的含量，真实反映产品的质量。
附图说明
图1为实施例中阿普斯特线性图谱；
图2为实施例中强降解试验的色谱图谱，Y轴是出峰强度，X轴是出峰时间，其中图2(A)对应碱破坏，图2(B)对应酸破坏，图2(C)对应高温破坏，图2(D)对应光破坏，图2(E)对应氧化破坏。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
实施例：阿普斯特片有效成分的含量测定
1、仪器与试剂
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得，所提及的流动相均为2,4-二甲基-3-戊醇：2-甲基-2-己醇：10mmol/L 3-甲基丁酸铵＝35：60：5组成的流动相，其中，3-甲基丁酸铵的制备方法为：将三乙胺溶液的浓度稀释至0.1％，加入浓度为10％的3-甲基丁酸，调节pH至6.2，得到10mmol/L 3-甲基丁酸铵，且制备得到的流动相的pH值也为6.2；
所提及的稀释剂均为2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的稀释剂。
试剂：2-甲基-2-己醇，2,4-二甲基-3-戊醇均为色谱纯，磷酸氢二钠缓冲液、3-甲基丁酸、三乙胺溶液均为分析纯。
样品：北京润德康医药技术有限公司提供。
对照品：阿普斯特对照品(批号：J08373P1)由诺华制药有限公司提供，供含量测定用。
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent公司)，DV215CD电子天平(OHaus discovery公司)，UV-1750紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，410HT-超声波清洗仪(广州市星烁仪器有限公司)。
2、该阿普斯特片有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取阿普斯特对照品适量，加2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的稀释剂，制成每l ml含阿普斯特20μg的溶液，作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取样品阿普斯特片20片(约相当于阿普斯特10mg)，置研钵中研细过四号筛，精密称定，置50mL容量瓶中，加2-甲基-2-己醇：磷酸氢二钠缓冲液＝25：75组成的稀释剂振摇使溶解，超声5min，过滤，滤液放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置10mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得制成浓度为20μg/mL的阿普斯特供试品溶液；
(3)高效液相色谱条件：
色谱柱：OJ-RH C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：2,4-二甲基-3-戊醇：2-甲基-2-己醇：10mmol/L 3-甲基丁酸铵＝35：60：5；检测波长：242nm；流速:1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；理论板数按阿普斯特峰计算应不小于6000；进样方式：自动进样；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3、线性关系的考察
取阿普斯特对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成浓度为400μg/mL的母液，用稀释剂逐级稀释最终浓度为2、5、10、16、20、30μg/mL的溶液，分别精密量取各溶液20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图。以阿普斯特峰面积(A)为纵坐标，阿普斯特溶液浓度(C)为横坐标，得到回归方程A＝50.403C-4.2686(R2＝0.9998，如图1，结果表明，阿普斯特在2.06～30.86μg/mL线性范围内良好。
4、强降解试验的考察
取阿普斯特对照品约20mg，置于50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置于20ml容量瓶中，分别在下述条件下进行试验：
(1)碱破坏：加0.01mol/L氢氧化钠溶液1ml，室温避光放置约24小时，加0.01mol/L盐酸溶液中和，加流动相至刻度，摇匀作为碱降解产物溶液；
(2)酸破坏：加0.1mol/L盐酸溶液1ml，室温避光放置约24小时，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml中和，加流动相至刻度，作为酸降解产物溶液；
(3)高温破坏：另取阿普斯特对照品适量于称量瓶中，置100℃烘箱内24h后取出，放冷至室温，精密称取约20mg，置于50ml容量瓶中，加异戊烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置于20ml容量瓶中用流动相稀释至刻度，摇匀，作为高温降解产物溶液；
(4)光破坏：用流动相稀释至刻度，在4500±500lx的光照条件下放置约24小时，作为光降解产物溶液；
(5)氧化破坏：加3％过氧化氢1mL，室温避光放置约24小时，用流动相稀释至刻度，作为氧化破坏产物溶液。
分别精密量取上述5种溶液各10μl注入液相色谱仪，在上述含量测定方法(3)高效液相色谱条件下进行测定。结果如图2所示，结果表明：阿普斯特经酸、碱、氧化、高温、光照破坏，阿普斯特峰纯度符合要求，降解产物峰不干扰主成分的测定。
5、稳定性试验的考察
取样品阿普斯特片约25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置于20ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，照含量测定方法(3)高效液相色谱条件下精密量取20μl分别于0、2、4、8、12、16、24h进行测定，记录色谱图。结果见表1，考察发现待测溶液的峰面积变化率小于2％，表明本品在室温条件下放置10h稳定。
表1阿普斯特溶液稳定性实验结果
6、重复性试验：
取同一批样品阿普斯特片，按供试品溶液的制备方法重复配制供试品溶液6份，进行含量测定，记录色谱图。结果见表2，在本色谱条件下6份阿普斯特的平均含量为99.8％，RSD(n＝6)为0.3％，结果表明该含量测定方法的重复性良好。
表2阿普斯特含量重复性实验结果
7、准确度试验：
精密称取阿普斯特样品约16mg，20mg，24mg各三份，分别置于50ml容量瓶中，分别加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，制备成为浓度分别为80％、100％及120％的供试品溶液，另取阿普斯特对照品以相同方法制备对照品溶液，精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入液相色谱仪中记录色谱图，根据对照品溶液的色谱数据做出标准曲线，由标准曲线算出测得量，结果见表3，在拟定的色谱条件下，三个浓度下的阿普斯特的回收率均在98.2％～99.7％之间，RSD值为0.1％，证明该含量测定方法具有良好的准确度。
表3阿普斯特准确度结果
8、中间精密度试验：
由两名不同试验人员在不同试验仪器上配制供试品溶液及对照品溶液，精密量取供试品溶液及对照品溶液20μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。结果表明两组共12次测定结果阿普斯特的含量的平均值为99.8％，RSD值0.3％，符合规定，该方法具有一定的中间精密度。
综上所述，本发明一种阿普斯特片有效成分的含量测定方法，能够便捷、准确、可靠地测定出阿普斯特的含量，真实反映产品的质量。
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。