巧光激发后发射波长在370?400皿之 间；同型半脱氨酸核酸适体巧光探针与同型半脱氨酸结合时，同型半脱氨酸诱导其发生结 构改变，核酸适体5'和3'两端的巧分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，巧光激发后激 发态二聚体发射波长在480到500nm之间。
[0023] W上所述的一种用基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒来检测同型 半脱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含N&Cl、 Tris、邸TA-N32的红细胞裂解液为含有1?280mmol/L NH4CI，1?34mmol/L Tris, 1? 2mmol/LEDTA-Na2, pH7. 0 ?7. 2 ;所述含 MgCla的 0. 2M 磯酸缓冲液为含有 1 ?lOmmol/L MgCl,;所述巧光检测仪为具有时间分辨巧光测定的巧光检测仪。
[0024] W上所述的一种用基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒来检测同型半 脱氨酸浓度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半 脱氨酸浓度。
[0025] 本发明的原理是：在不与同型半脱氨酸时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和 3'两端的巧分子单体相互游离，巧光发射波长在370到400nm之间；与同型半脱氨酸结合 时，同型半脱氨酸诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5'和3'两端的巧分子单体相互 靠近，形成二聚体，巧激发态发射波长二聚体在480到500nm之间。巧激发态二聚体巧光寿 命有着长达l(K)ns，比生物样品自发巧光寿命（约为5ns)长，通过检测同型半脱氨酸核酸适 体探针和样品混合后的巧光强度和巧光寿命，计算样品中同型半脱氨酸的浓度。
[0026] 本发明的实质性特点和显著进步是：
[0027] (1)检测操作简单快速，无需复杂样品加工和分离，将核酸适体探针直接加入裂解 后的血样液，用巧光分光光度计短时间内就可W检测480?500nm处的巧光值；
[002引 （2)本试剂盒及其检测方法具有灵敏度高，检测结果重复性高，样品检测误差在 0. 01?0. 1%之间，特异性强，同型半脱氨酸核酸适体巧光探针不与同型半脱氨酸结合时， 核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的巧分子单体相互游离，巧光激发后发射波 长在370?400nm之间；其与同型半脱氨酸结合时，同型半脱氨酸诱导其发生改变，核酸适 体5'和3'两端的巧分子单体相互靠近，形成二聚体，巧光激发后二聚体发射波长在480? 500nm之间。
[0029] (3)所用的试剂可W使配制好可直接使用的液体试剂或是使用前加水溶解后使用 的干粉状态，检测试剂可W常温贬存，运输方便。
【具体实施方式】
[0030] W下结合表1和实施例描述本发明基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸H切试 剂盒及其检测方法。
[0031] 表1.实施例中的试剂盒试剂成分组成
[0032]
【主权项】
1. 一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，主要成分包括： 含NH 4C1、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含MgCl 2的0. 2M磷酸缓冲液；同型半胱氨酸 标准品；同型半胱氨酸核酸适体荧光探针；所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为5'和 3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为SEQ ID NO: 1~SEQ gattggaact ggcataaccc〇
2. 根据权利要求1所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征 在于，所述含NH4C1、Tris、EDTA-Nad^J红细胞裂解液为含有1?280 mmol/L NH4C1，1~34 mmol/L Tris, l~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0~7. 2 ;所述含]\%(：12的 0? 2M 磷酸缓冲液为含有 1-1 Ommol/],MgCl2〇
3. 根据权利要求1或2所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其 特征在于，所述含NH4C1、Tris、EDTA-Nad^红细胞裂解液、含MgCl 2的0. 2M磷酸缓冲液、同 型半胱氨酸标准品、同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使 用前需加水溶解的干粉状态。
4. 根据权利要求1~3所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特 征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸浓度。
5. -种用权利1~3任一所述基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同 型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括： (1) 血样裂解：将血样和含见14(：1、1'1^8 4014-似2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混 勾，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液； (2) 混合卵育：取20~100 y 1步骤1)得到的上清液和30~50ul的用含1%(：12的0. 2M 磷酸缓冲液，溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针 试剂混合，室温下卵育5~15min，使同型半胱氨酸核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到 测试液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算：使用生物医学作图软件，参照同型半胱氨酸标准样品制作的标准曲线， 结合步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中同型半胱氨酸的浓度。
6. 根据权利要求5所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来 检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂中 同型半胱氨酸核酸适体荧光探针浓度为200~400 nmol/L，所述同型半胱氨酸核酸适体荧 光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为： ggcactgtac ggctaagttc ccggatagtg gattggaact ggcataaccc〇
7. 根据权利要求6所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检 测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针不与同 型半胱氨酸结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离， 荧光激发后发射波长在370~ 400nm之间；所述的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针与同型 半胱氨酸结合时，同型半胱氨酸诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体 相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在480到500nm之间。
8. 根据权利要求5所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来 检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所 述含順4(：1、1^8、￡014-似2的红细胞裂解液为含有1~280臟〇1/1順 4(：1，1~34臟〇1/ L Tris, l~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0~7. 2 ;所述含]\%(：12的 0? 2M 磷酸缓冲液为含有 l~10mmol/L MgCl2;K述荧光检测仪为具有时间分辨荧光测定的荧光检测仪。
9. 根据权利要求5~7所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来 检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血 中的同型半胱氨酸浓度。
【专利摘要】本发明涉及一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸HCy试剂盒，同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸HCy浓度的方法、测定试剂组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：红细胞裂解液、磷酸缓冲液PBS、同型半胱氨酸HCy标准品、同型半胱氨酸HCy核酸适体荧光探针；通过血样裂解、混合卵育处理，结合荧光分光光度计检测，从而测算出同型半胱氨酸HCy的浓度大小。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，检测特异性强，灵敏度高，检测结果重复性高等优点。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104597008
【申请号】CN201410717094
【发明人】陈燕婷, 张莘蔓, 李红梅
【申请人】陈燕婷, 张莘蔓, 李红梅
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年11月30日