中，置于4°C备用；
稀土荧光纳米微球标记肌钙蛋白I单克隆抗体的制备:将1.5mg用于检测的肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)用上述碳酸盐缓冲液于4°C透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4°C反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4°C反应4小时；再加入等体积的封闭液(150mM Tris-HCL, pH7.5，含3%BSA，5%蔗糖)，4°C封闭过夜；然后用150mM Tris-HCL, pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100 μ I的150mMTris-HCL 缓冲液中(含 1.2%NaCL, 2%BSA, l%Tween 20)，4°C避光保存备用；
3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4的制备:
根据2+2模式，购买并筛选高质量的单克隆抗体，进行配对实验，筛选出捕获抗体和检测抗体各两种，将用于捕获的2种抗体，按照后续工作需要分装后保存于-20°C备用；
分别用包被稀释液将肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到l_5mg/ml，膜液量为1_2 μ 1/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7_，然后置于烘箱中，37°C烘干2小时；
试纸卡的组装:在PVC板I上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4_宽,将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
[0022]上述各步骤中选用的设备及原料优选以下原料:
肌钙蛋白I特异性配对抗体:捕获抗体M18+560，检测抗体19C7+MF4，芬兰HYTEST有限公司；肌钙蛋白I质控品:英国朗道实验诊断有限公司；稀土荧光微球:上海甄准生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC)膜:Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma产品，其它常用试剂均为分析纯试剂。
[0023]实施例2:准确度试验
选用上述试纸卡以及荧光免疫层析分析仪(型号:NE0-007)，
荧光免疫分析仪参数的设定:在荧光免疫分析仪上设定好试纸卡工艺参数后，取上述组装好的试纸卡，分别用0.1,0.25、1、2.5、10、20、40ng/ml的肌钙蛋白I校准品，用试纸卡进行测定，得到各校准品的荧光强度值，将结果输入到分析仪的参数中，完成分析仪的参数的设定。
[0024]主要检测材料:临床样本由相关医院获得,共200份电化学发光免疫法定值样本，其中血清样本100份，全血样本100份，肌钙蛋白I含量分布区间为0-40ng/mL之间。
[0025]检测方法: 步骤1:将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；
步骤2:精确吸取25 μ I血清样本，样本为全血时吸取50 μ I样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100 μ L样本稀释液(生理盐水或PBS)，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；
步骤3:设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。
[0026]试验结果分析:
临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果O
[0027]试验结果:
如附图2所示，以实验系统的检测值为Y轴，以对照系统的测验值为X轴，绘制散点图，并进行相关性分析。临床样本检测对200份临床定值样本检测，样本平均偏差值小于10%，最大偏差小于20%，R2>0.98，一致性系数>0.90。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。
[0028]实施例3:精密度试验
采用实施例2的试纸卡和测量系统，对本发明的试纸卡和荧光免疫层析分析仪进行精密度实验。
[0029]主要检测材料:临床样本由相关医院获得,共2份化学发光免疫法定值血清样本，其中低值定值样本临床测量值为0.13ng/ml，高值定值样本临床测量值为1.55ng/ml。
[0030]检测方法:
采用实施例2的试纸卡和测量系统，对2份定值样本各进行重复测定20次。
[0031]试验结果分析:
临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对临床样本进行检测，并分析检测结果。
[0032]试验结果:
如表I所示，对临床测量值为0.13ng/ml的低值定值样本和临床测量值为1.55ng/ml的高值定值样本重复测定20次后计算平均值，标准差和CV，所得结果显示用本发明的实验系统测试低值定值样本CV为8.59%，测试高值定值样本CV为5.88%。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。
[0033]本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于肌钙蛋白I定性胶体金试剂，能定量检测样本中的肌钙蛋白I含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
【主权项】
1.一种肌钙蛋白I检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有:PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为2+2模式，即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成，以同时保证特异性和亲和力。
2.根据权利要求1所述的一种肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土突光微球的直径优选是90-1 1nm ;所述稀土突光微球掺杂有稀土镧系兀素。
3.根据权利要求2所述的一种肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于2种不同的单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种肌钙蛋白I质检测试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中，4°C浸泡4小时，然后取出37°C烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在B1-DotXYZ3050三维喷点平台上，用B1-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37°C烘干2小时后制得。
5.根据权利要求4所述的一种肌钙蛋白I质检测试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体采用如下步骤制得: 步骤1:单克隆抗体的获得:根据2+2模式，购买并筛选高质量的单克隆抗体，进行配对实验，筛选出捕获抗体和检测抗体各两种，将用于检测的2种抗体，按照后续工作需要分装后保存于_20°C备用； 步骤2:稀土荧光微球的醛基化:取1.5mg稀土荧光微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗漆3遍,离心速度为12000rpm,时间为5分钟,最后重悬于100 μ I的上述碳酸盐缓冲液中，加入150 μ I醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μ I的上述碳酸盐缓冲液中，置于4°C备用； 步骤3:稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体的制备:将1.5mg用于检测的肌钙蛋白I单克隆抗体(两种抗体按照质量比1:1混合)用上述碳酸盐缓冲液于4°C透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4°C反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4°C反应4小时；再加入等体积的封闭液，4°C封闭过夜；然后用150mM Tris-HCL, pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100 μ I的150mM Tris-HCL缓冲液中，4°C避光保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种肌钙蛋白I质检测试剂盒，其特征在于所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得: 步骤1:根据前述筛选和配对实验，选择用于捕获的2种抗体，按照后续工作需要分装后保存于_20°C备用； 步骤2:分别用包被稀释液将肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到l-5mg/ml，膜液量为1_2 μ 1/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7_，然后置于烘箱中，37°C烘干2小时。
7.根据权利要求1所述的一种肌钙蛋白I质检测试剂盒，其特征在于所述样品垫通过以下步骤制得:将玻璃纤维膜浸泡于含有1.5%Triton X-100, 2% BSA, 0.15M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4°C浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37°C烘干2小时。
8.一种利用如权利要求1-7中任意一项所述试剂盒实现的肌钙蛋白I检测方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤1:将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放； 步骤2:精确吸取25 μ I血清样本，样本为全血时吸取50 μ I样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100 μ I样本稀释液，样本稀释液采用生理盐水或PBS，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果； 步骤3:设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对肌钙蛋白I的检测范围为0-40ng/mL。
【专利摘要】本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为2+2模式，即捕获抗体和检测抗体都是分别由2种高质量的单克隆抗体混合而成，以同时保证特异性和亲和力。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点。
【IPC分类】G01N33-68, G01N33-577
【公开号】CN104730251
【申请号】CN201410704444
【发明人】王鹏浩, 王有志, 蔡荣
【申请人】威海纽普生物技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2014年11月28日