0023] 二、通过圆二色谱实验对多肽-Au纳米复合材料的生物相容性进行评价。
[0024] 将肌红蛋白适配体、多肽-Au纳米复合材料与肌红蛋白适配体孵化后的混合液以 及该混合液与与不同浓度的肌红蛋白相互作用，分别上机检测。圆二色谱测试参数：参比溶 液为PBS，石英比色皿厚度为I mm，扫描范围180-280 nm，步阶为LO nm〇
[0025] 实验结果见图3。图3中曲线a为肌红蛋白适配体的圆二色谱图。多肽-Au纳米 复合材料与肌红蛋白适配体结合后的峰形峰位置非常相似(如曲线b所示)，说明多肽-Au 纳米复合材料能够很好地保持肌红蛋白适配体的结构，具有良好的生物相容性；当肌红蛋 白出现时，肌红蛋白适配体的构象发生改变(如曲线c所示）；进一步提高肌红蛋白浓度，圆 二色谱中峰形强度大幅变化(如曲线d所示)。以上结果反映了多肽-Au纳米复合材料不会 影响肌红蛋白适配体构象的转换，具有良好的生物相容性。
[0026] 三、将多肽-Au纳米复合材料修饰于工作电极表面，再在电极表面固定肌红蛋白 适配体，用差分脉冲伏安法进行电化学检测。
[0027] 玻碳电极依次用0. 3和0. 05 μ m的a -Al2O3抛光至镜面，再用乙醇和超纯水超声 处理。将7 yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)滴到电极表面，室温下干燥，APTES通过 硅氧键偶联到电极表面。将5 UL多肽-Au纳米复合材料滴到预处理后的电极上，自然晾 干。多肽-Au纳米复合材料与APTES末端的氨基相结合固定于电极表面。
[0028] 将肌红蛋白适配体以高纯水稀释，取得肌红蛋白适配体浓度为I μΜ的肌红蛋白 适配体溶液。将已修饰材料的电极浸泡于肌红蛋白适配体溶液中，经过4小时后取出，晾 干，肌红蛋白适配体末端的氨基与修饰材料的电极表面共价结合固定，即得到应用于肌红 蛋白检测的适配体传感器。应用于肌红蛋白检测的适配体传感器不使用时存储在4°C冰箱 中。
[0029] 以上肌红蛋白适配体的氨基酸序列为： 5' -NH2-CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3'。该适配体是在 2013 年 6 月发表的硕士毕业论文《核酸探针电化学传感器用于小分子和肌红蛋白检测的研宄》中公 开过的适配体 5' -CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3' 的基础上由生工生物 工程(上海）股份有限公司合成5'末端带册12的新型肌红蛋白适配体。在保留原有适配体 能与肌红蛋白特异性结合的优点外，该肌红蛋白适配体的末端还能与纳米材料共价结合。
[0030] 示差脉冲伏安法由CHI 660D型电化学工作站完成，采用常规的三电极体系进行 检测，工作电极为修饰后的玻碳电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂丝。示差 脉冲伏安曲线是连续向电解池中加入不同浓度(本试验用的肌红蛋白浓度为：〇.〇〇2g/L， 0· 005g/L，0· 02g/L，0· 05g/L，0· 2g/L，0· 5g/L，lg/L)的肌红蛋白得到的，其中电解液是含 10禮[卩6(0吣6/^6(0吣6]" 4-和0.1]?1((：1的0.1]\1?85(?!1=7.0)溶液。
[0031] 实验结果见图4,表4中曲线a到g分别代表的肌红蛋白浓度为：0. 002g/L， 0. 005g/L，0. 02g/L，0. 05g/L，0. 2g/L，0. 5g/L，lg/L。随着肌红蛋白浓度的增加，峰电流逐渐 减少，这是由于结合到电极表面的肌红蛋白浓度增大，电极表面的电阻增大，电子转移被抑 制所造成的。
[0032] 实验结果见图5。根据肌红蛋白浓度与电流响应的标准曲线，在肌红蛋白浓度 0. 002~I g/L的检测范围内存在良好的线性关系。
[0033] 以上结果表明该电化学适配体传感器具有较好的性能，能够应用于定量检测肉品 中肌红蛋白的浓度。
[0034] 实验结果如图4、5所示。该方法对肌红蛋白的检测范围宽（0. 002~lg/L)，检测 限达到0.581 yg/L。检测实例见下表。并且该传感器具有很好的抗干扰性能，可以保存 15天不失去活性。
【主权项】
1. 应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法，将多肽和HAuCl 4溶解于去 离子水中，置于-15°C搅拌12小时后在O~5°C环境下与NaBH4反应，取得多肽-Au纳米复 合材料；将多肽-Au纳米复合材料修饰在电极表面，再通过共价连接肌红蛋白适配体，即得 应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。
2. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述多肽、HAuCl 4、去离子水和NaBH^ 混合体积比为1 :3~5 :100 :3。
3. 根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于：将3-氨丙基三乙氧基硅烷滴涂于 洁净的玻碳电极表面，室温干燥后，再将多肽-Au纳米复合材料修饰于电极表面，晾干，即 得修饰有多肽-Au纳米复合材料的电极。
4. 根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于：将修饰有多肽-Au纳米复合材料 的电极置于肌红蛋白适配体溶液中浸泡4小时后取得，晾干，即得应用于肌红蛋白检测的 适配体传感器。
【专利摘要】应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法，涉及一种电化学传感器技术领域，将多肽和HAuCl4溶解于去离子水中，置于-15℃搅拌12小时后在0～5℃环境下与NaBH4反应，取得多肽-Au纳米复合材料；将多肽-Au纳米复合材料修饰在电极表面，再通过共价连接肌红蛋白适配体，即得应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。该电化学适配体传感器检测范围宽，重现性好，避免了肉品中常见干扰物质的影响，结果准确，能够应用于肉品中肌红蛋白的检测。
【IPC分类】G01N27-327, G01N33-68
【公开号】CN104807865
【申请号】CN201510234067
【发明人】孙冲, 王道营, 耿志明, 张牧焓, 徐为民, 刘芳, 诸永志, 卞欢, 吴海虹
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月8日