设计2条单链oligo: 01i go1 ：TAGGGCTCAAACCGGTTGTTGACA,o。go2:AAACTGTCAACAACCGGTTTGAGC。
[0034] oligol和oligo2退火形成双链DM,将双链DM连入经Bsal酶切的pUC57-sgRNA (Addgene 51132)构建sgRNA表达载体。
[0035]W上述构建的SgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7启动子 及引导序列的DNA片段： 化rward primer :GATCCCTAATACGACTCACTATAG， Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT〇
[0036]W所扩增的PCR产物为模板使用MEGAshortscriptKit(Ambion，AM1354)进行体 外转录；化s9质粒（Addgene44758)通过T7叫trakit(Ambion，Aml345)进行转录。将 转录得到的化s9和引导序列RNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiaen，217084)纯化 后，通过化mtoJet5247显微注射系统注射入野生型巧7BL/6小鼠的单细胞受精卵内。选 取经显微注射后存活的受精卵，将其移植到健康雌鼠输卵管中，经过21天妊娠之后得到F0 代小鼠。
[0037]F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定，野生型小鼠包含一段长137bp的DNA序列，而突 变小鼠（Nulpl基因敲除小鼠)含有126bp的DNA序列，最终蛋白产物通过western blot进 行检测鉴定。其中，PCR鉴定引物如下： NUlin-238-F :5' -GAGGAAGAGGGACCAAAACC-3'， NULP1-238-R:5' -GTCATGCCCCCACCATTT-3'。
[0038] 实验所用小鼠为突变体纯合子。
[0039] (2)屯、脏特异性Nulp1转基因小鼠的构建： W野生型巧7BL/6小鼠Nulpl基因cDNA为模板，用如下引物PCR扩增小鼠Nulpl全长 基因（NCBI，NulplmusNM_001037877. 3): 上游引物：TGCTCTAGAGCCACCATGTCGCGCCGGGCCCTCCGGAGACTGA， 下游引物：TGCTCTAGATTACAGCTGCTCTGTGGTGTA。
[0040]扩增的Nulpl全长基因及pCAG-loxP-CAT-loxP质粒（pCAG-loxP-CAT-loxP质粒 由北京协和医学院基础学院杨青林老师提供，制备过程参见文献：KimT，Zhely油ovska0， LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouse ModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-Activated Rec巧tors(PPARs)，57.)经甜al(肥B，#R014化）酶切后连接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP -NULPl-hGHpA载体（CAGkhickenbeta-actin)-CAT(chloramphenicol-NULPl-hGHpA)，将 构建的质粒通过显微注射系统注射入野生型巧7BL/6小鼠的单细胞受精卵内，该受精卵移 植入健康雌鼠中，发育得到F0代小鼠。将得到的F0代小鼠与a-MHC-化e小鼠杂交，并通 过他莫昔芬诱导(他莫昔芬80mg/kg/D，腹腔注射，连续刺激5天)得到屯、脏特异性NULP1转 基因老鼠（上述的转基因小鼠参照下述文献制备JiangDS，BianZY，ZhangY，ZhangSM, LiuY,ZhangRetal.Roleofinterferonregulatoryfactor4intheregulationof pathologicalcardiachypertrophy.Hypertension2013;61:1193-1202.)。
[0041] 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在SPF级实验动物中屯、，SPF级大小鼠饲料购自北 京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室溫在22-24°C之间，湿度在40-70%之间，明暗交 替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0042] 实施例1Nulpl在正常人和屯、肌病患者屯、脏中的表达 选用正常人屯、脏(非屯、脏原因的死亡捐献的个体)、扩张型屯、肌病患者屯、脏(做屯、脏移 植手术病人置换的受体，DCM)，对屯、脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot),结合特异性识Nulpl蛋白和屯、肌细胞肥大标志物ANP(Millipore，AB2232)、P-MHC (Santacruz，sc53090)的抗体进行检测，测定其Nulpl(BETHYLA303-087A)的表达，GAPDH (CellSi即alingTechnology, 2128)作为内参。检测结果如图1所示，扩张型屯、肌病(扩屯、 病）患者屯、脏中的屯、肌细胞肥大标志物ANP、P-M肥的表达明显上调，Nulpl的表达明显下 调（图1)。
[0043] 实施例2Nulpl在野生型小鼠假手术组和屯、肌肥厚模型组屯、脏中的表达 1.采用主动脉弓缩窄手术（AB)建立小鼠屯、肌肥厚模型，模型操作流程： 1. 1术前准备 (1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊己比妥钢）量，通过腹 腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般 注射后约lOmin无明显反应，W麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳 手术时间)。
[0044] (2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢蔽下的皮肤去毛。剌毛后用湿纱 布擦拭术区去除鼠毛，W不影响手术视野为宜。
[0045] (3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上口齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经 声口准确插入气管内，随后右侧邸位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管 与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。
[0046] 1. 2主动脉弓缩窄术（AB) AB术屯、肌肥厚模型组：取右侧邸位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两 前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用舰酒及体积分数为75%酒精对手术区域 皮肤消毒。左手持眼科綴将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉 及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝 线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G(25. 0-27. 5g小鼠）或者27G(23. 5-25.Og) 注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完 毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出Icc气体W恢复胸腔内负压， 拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。
[0047] 假手术组（Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同AB术屯、肌肥 厚模型组。
[0048] 1.3术后护理 手术中主动脉弓降支结扎后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插 管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观 察。
[004引2.取材 打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯綴夹住屯、耳下方的血管蒂，剪下屯、 脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压屯、腔内液体，薩干表面液体后，称重并记录，将屯、脏放入 相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80°C冰箱保存后用于分子生物学检测。
[0050] 3.Nulpl在化am组小鼠和屯、肌肥厚模型组小鼠屯、脏中的表达 分别选野生型小鼠化am组和屯、肌肥厚模型组AB手术后4周及8周的屯、脏，对屯、脏提 取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot),结合特异性识别Nulpl蛋白及屯、 肌细胞肥大标志物ANP、P-M肥的抗体进行检测，测定其Nulpl的表达，GAPDH作为内参。检 测结果如图2所示，屯、肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、P-M肥的表达明显上调，Nulpl的 表达在AB术后明显下调（图2)。表明发生屯、肌肥厚的屯、脏Nulpl的表达下调。
[0051] 实施例3Nulpl在对照组（PBS)或血管紧张素II(AngII)或苯肾上腺素（PE) 刺激后的屯、肌细胞中的表达 分离培养新生1天Sprague-Dawley乳鼠屯、肌细胞，培养原代屯、肌细胞4化后换液(原 代新生SD大鼠屯、肌细胞培养的具体过程见下述实施例4)，加入无血清的DMEM/F12饥饿屯、 肌细胞1化使细胞同步化后，分别给予PBS、血管紧张素II(Ang 苯肾上腺素（PE， 1yM)刺激48小时，对屯、肌细胞提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Westernblot), 结合特异性识别Nulpl蛋白及屯、肌细胞肥大标志物ANP、P-M肥的抗体进行检测，测定其 Nulpl的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图3所示，经血管紧张素II(AngII)或苯肾 上腺素（PE)刺激后的屯、肌细胞中ANP、P-M肥的表达叶明显上调，Nulpl的表达明显下调。
[0052] 实施例4Nulpl干扰（AdshNulpl)及过表达（AdNulpl)腺病毒对AngII刺激 的原代屯、肌细胞肥大的影响 1.原代新生SD大鼠屯、肌细胞培养 (1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部W下75%酒精消毒，用眼科剪和显微綴取 下屯、脏，放入盛有10血DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复W上过程。
[005引（2)用DMEM/F12培养基清洗屯、脏，并将屯、脏剪成l-2mm3的碎片。转入到放有转子 的血清瓶中，吸去DMEM/F12,加入膜酶消化液。转速为12化/min,消化15min，静止数秒钟， 弃去上清液。
[0054] (3)加入膜酶消化液，转速为12化/min,消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用 20%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4°C冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。 取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
[00巧](4)将收集好的屯、肌细胞悬液，W1500巧m转速离屯、8min，弃去上清液。在离屯、管 中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离屯、管中，细胞悬液用细胞40ym 过滤网过滤。
[005引 （5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过 滤。根据细胞悬液的总量加入化化（终浓度0.ImM)，混匀之后，加入到用0. 1%明胶包被的 器皿中。
[0057] (6)轻摇分散细胞，勿縱满摇晃。37°C、5%C〇2解育48小时用PBS清洗1次，更换 培养基。
[0058] 2.Nulpl干扰（AdshNulpl)及过表达（AdNulpl)腺病毒对经AngII诱导的屯、 肌细胞肥大模型的影响 AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照）、AdshNulpl(含shRNA-Nulpl(沉默RNA-Nulpl融合蛋白）的腺病毒)、AdGFP(含GFP(绿色巧光蛋白）的腺病毒，用作对 照）及AdNulpl(含GFP-Nulpl(绿色巧光蛋白-Nulpl融合蛋白）的腺病毒）（运些腺病 毒的构建过程参见文献：QienK,GaoLLiuY,etal.Vinexin-Pprotectsagainst cardiachypertrophybyblockingtheAkt-dependentsignallingpathway[J].Basic 化5Car扣2013，108(2): 1-14.