一种马西替坦有关物质的高效液相色谱分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化学药物纯度的分析方法，具体地说是一种马西替坦有关物质的 高效液相色谱分析方法。 二、
【背景技术】
[0002] 马西替坦（Macitentan)，化学名为N-[5-(4-溴苯基）-6-[2-[ (5-溴-2-嘧啶基） 氧]乙氧基]-4-嘧啶基]-Ν'-丙基磺酰胺，化学结构式如下式（I):
[0003]
[0004] 马西替坦是一柙双冋円反累党怀栢沉刑，田垌士茇口」忝陲制约公司（Actelion Pharmaceuticals Inc.)开发。2013年10月18日获美国FDA批准，用于治疗肺动脉高压 (PAH)，以延缓疾病进展。
[0005] 马西替坦杂质较多，从结构上看，5-(4-溴苯基）-4, 6-二取代啼啶母核及二乙氧 结构中均有两个活性等同的反应位点（氯原子、羟基），合成过程中会产生双缩合杂质（杂 质A、杂质B、杂质C、杂质D)及水解杂质（杂质E、杂质F、杂质G);马西替坦分子中不稳定 的磺酰胺结构水解产生杂质H、杂质I及杂质J，芳醚结构水解产生杂质E及杂质K，氧化降 解产生杂质I及杂质J。从来源看，马西替坦原料的杂质主要来源于合成过程中引入的反应 原料、合成中间体、反应副产物及降解杂质，马西替坦制剂的杂质来源于原料引入杂质、工 艺杂质及降解杂质。
[0006]目前马西替坦原料及其制剂的分析方法还没有相关的文献报道。 三、
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一种马西替坦有关物质的高效液相色谱分析方法。
[0008] 针对现有文献对马西替坦原料及其制剂杂质鉴定研究的缺失，发明人通过工艺试 制、强制降解试验对马西替坦杂质进行富集、分离提纯，鉴定了 18个主要已知杂质，并且对 杂质进行了溯源归属，包括马西替坦合成中间体（杂质〇、杂质P、杂质Q、杂质R)、马西替坦 合成副产物（杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G)及降解杂质（杂质H、杂 质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N)。
[0009]
[0010] 发明人曾试图通过等度洗脱分离各已知杂质，但在保证各杂质达到基线分离的情 况下色谱保留时间大于2h，耗时，不实用。因此，改用梯度洗脱法，经对流动相组成及比例的 优化筛选，确定本发明的分析方法。同时按中国药典2010年版二部附录VD(高效液相色 谱法）及附录XIXA(药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义和验证方法，进行专属 性验证，结果表明该方法可同时分析马西替坦原料及其制剂中的所有已知杂质，并且可通 过加校正因子的主成份自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻 杂质峰之间的分离度均大于1. 5,主峰与各杂质峰峰纯度均为1. 0。
[0011] 所述"峰纯度"是指采用配有相应分析软件的光二极管阵列检测器，采集、记录、分 析经色谱柱分离组份的光谱数据，自动生成的表征特定分离组份对应的光谱特征一致性的 加权值。
[0012] 本发明马西替坦有关物质的高效液相色谱分析方法，采用反相色谱柱及紫外检测 器，是以乙腈-水-甲酸的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱，包括如下步骤：
[0013] (1)样品配制：取马西替坦原料，用体积比为1 : 4的碳酸氢铵缓冲液（取碳酸氢 铵1. 58g，加水1000ml使溶解，用氨水调节pH值至9. 0)-乙腈溶液超声溶解，过滤或离心， 配制成浓度为〇. 1-1. 5mg/ml的马西替坦溶液；
[0014] (2)色谱条件设置：采用反相C18柱，柱温设置在20-50°C;以体积比 为49 : 49-54 : 0. 05-0. 15的乙腈-水-甲酸混合液为流动相A，以体积比为 85 : 14-17 : 0.05-0. 15的乙腈-水-甲酸混合液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为 0. 5-2.Oml/min;检测波长为250-270nm;洗脱液由流动相A和流动相B构成；
[0015] (3)检测：取步骤⑴配制的马西替坦溶液，进样10-50μ1，记录色谱图。
[0016] 步骤（2)中反相C18 柱选自GraceSmartC18 (250X4. 6mm，5μm)、Agilent C18 (250X4. 6mm，5μm)或ApolloC18 (250X4. 6mm，5μm)，优选AgilentC18 (250X4. 6mm， 5μm) 〇
[0017] 步骤（2)中流动相A为乙腈、水和甲酸按体积比49 : 50-52 :0·08-0. 12 混合构成，优选体积比为49 : 51 : 0.1;流动相B中为乙腈、水和甲酸按体积比 85 : 14-16 : 0.08-0. 12混合构成，优选体积比为85 : 15 : 0.1。
[0018] 步骤（2)中梯度洗脱程序为：0-10min流动相A占洗脱液的体积百分比为100%， 10min-35min流动相A占洗脱液的体积百分比由100%逐步递减至0%，35min-50min流动 相A占洗脱液的体积百分比为0%，50min-52min流动相A占洗脱液的体积百分比由0%逐 步递增至100%，52min-60min流动相A占洗脱液的体积百分比为100%。
[0019] 更优的洗脱程序为：
[0020] 0-10min流动相A占洗脱液的体积百分比为100%，10min-35min流动相A占洗脱 液的体积百分比由100%逐步递减至〇%，35min-40min流动相A占洗脱液的体积百分比为 0%，40min_42min流动相A占洗脱液的体积百分比由0%逐步递增至100%，42min_50min 流动相A占洗脱液的体积百分比为100%。
[0021]步骤（2)中流速为0·5-2. 0ml/min，优选0·5-1. 5ml/min;检测波长为 250-270nm， 优选 255-265nm。
[0022] 步骤（3)中进样量为10μ1-20μ1。
[0023] 采用本发明方法可有效地控制马西替坦原料及制剂中的有关物质，18个已知杂质 均能在一张图谱上分析出来，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1. 5， 主峰与各杂质峰峰纯度均为1. 〇。分析过程见实施例1，典型色谱图见图1，计算结果见表 1〇
[0024] 表1马西替坦与各已知杂质色谱分离参数结果
[0025]
[0026] 采用本发湳方法能"分析马西替j：旦在各种复-环境下的降解杂质，方法专属性 强。按中国药典2010年版二部附录VD(高效液相色谱法）及附录XIXA(药品质量标准 分析方法验证指导原则）的定义和验证方法，将马西替坦分别用酸、碱、高温、氧化、光照破 坏，制得破坏样品，按本发明方法分别采集各破坏样品色谱图，分析过程见实施例2,典型色 谱图见附图2~7。结果表明该方法能够分析经酸、碱、高温、氧化、光照破坏的样品，主峰与 各杂质峰均能达到基线分离，主峰纯度均为1. 〇。
[0027] 采用本发明方法能对各已知杂质进行定量分析。按中国药典2010年版二部附录 VD(高效液相色谱法）及附录XIXA(药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义和验 证方法，采用杂质对照法对马西替坦18个已知杂质的检测限、定量限进行检测，结果表明 该方法对各杂质的响应值高，能有效控制各已知杂质，结果见表2。
[0028] 表2马西替坦已知杂质定量分析验证参数结果
[0029]
[0030] 本发明首次对马西替坦原料及其制剂杂质进行溯源归属，鉴定了 18个已知杂质， 为马西替坦原料及其制剂有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极进步效 果和实际应用价值。 四、【附图说明】
[0031] 图1是实施例1马西替坦与已知杂质的混合色谱图（图中A为原图，B为放大图）。
[0032] 图2是实施例2酸破坏色谱图。
[0033] 图3是实施例2碱破坏色谱图。
[0034] 图4是实施例2高温破坏色谱图。
[0035] 图5是实施例2氧化破坏色谱图。
[0036] 图6是实施例2光照破坏色谱图。
[0037] 图7是实施例2未破坏样品色谱图。
[0038] 图8是实施例3马西替坦有关物质色谱图。
[0039] 图9是实施例4马西替坦片（10mg)有关物质色谱图。 五、【具体实施方式】
[0040] 实施例1 :
[0041] 检测仪器与色谱条件：
[0042] 高效液相色谱仪：LC-10AD栗，Sro-ΜΙΟΑ检测器
[0043]色谱柱：Agilent C18(250X4.6mm，5ym);流动相A:体积比为49:51:0· 1的 乙腈-水-甲酸溶液；流动相B :体积比为85:15 : 0. 1的乙腈-水-甲酸溶液；检测波 长：260nm ;流速：L Oml/min ;进样量：20μ1。
[0044] 实验步骤：
[0045] ⑴样品配制：
[0046] 取马西替坦、已知杂质A-R各适量，用体积比1:4的碳酸氢铵缓冲液（取碳酸氢 铵1. 58g，加水1000ml使溶解，用氨水调节pH值至9. 0)-乙腈溶液超声溶解并稀释制成含 马西替坦约为lmg/ml、杂质A-R均约为1yg/ml的溶液，作为样品溶液；
[0047](2)梯度洗脱程序设置：
[0048]
[0049] (3)检测：取上述样品溶液，分别进样20μ1，分