n。)将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入适量的抗牛病毒性腹与病毒抗体，在混勾仪上偶联lh。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的KMnF4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 °C待用。
[0025]2.单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面派射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥?自酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入抗牛病毒性腹泻病毒抗体，即将100 μ?100 Pg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
[0026]3.将粪便样品等进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了特异性单抗的酶标板上孵育20mins,若样品中存在目标病毒，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标病毒被固定在酶标板上。
[0027]4.将第1步所制的抗体修饰的KMnFjfi米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标病毒，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的目标病毒发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了病毒的探针。
[0028]5.加入定量的洗脱液(30%甲醇)将第4步的酶标板上的结合了病毒的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有目标病毒，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明病毒越多，通过加标验证定量检测样品中目标病毒的数目。
[0029]实施例2。
[0030]测定样品是否含有病毒一一猪细小病毒。
[0031]1.KMnF4纳米粒子制备:KMnF 4纳米粒子可以从市场购买，也可以采用以下方法制备:称取1.6mmol MnCl2*4H20加入到反应釜中，再加入10mL的无水乙醇，搅拌溶液至完全溶解；称取3mmol油酸钾加入上述溶液，搅拌l_2min，使其混匀；称取5_6g的氟化钾(KF)研磨lOmin以上，当其粒径变小变细之后，称取4.98mmol，将其加入之前的溶液中；再次加入无水乙醇，一般30mL ;夹套套紧，密封好后，将反应釜放入烘箱，将温度调制160°C，反应24h ;当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min ;将洗涤好的样品放入烘箱中，温度调至60°C，所得颗粒粒径一般是20nm。
[0032]KMnF4纳米粒子羧基修饰:将得到的1^必4与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90°C，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min ;将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的KMnF4纳米粒子。
[0033]抗体修饰:称取一定量的羧基修饰的腸必4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各lmL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。)将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入猪细小病毒单抗，在混勾仪上偶联lh。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的KMnF4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 °C待用。
[0034]2.单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面派射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥?自酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入猪细小病毒单抗，即将100 μ? 100 μδ/mL猪细小病毒抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
[0035]3.将样品进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了大单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在目标病毒，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标病毒被固定在酶标板上。
[0036]4.将第1步所制的抗体修饰的KMnFjfi米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有猪细小病毒，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的目标病毒发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合猪细小病毒的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了猪细小病毒的探针。
[0037]加入定量的洗脱液(30%甲醇)将酶标板上的结合了病毒的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有猪细小病毒，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明猪细小病毒越多，通过加标验证可以定量检测样品中目标病毒的数目。
【主权项】
1.一种基于KMnF 4纳米探针的NMR病毒快速检测方法，其特征是步骤如下: (1)检测目标病毒的KMnFjfi米探针的制备； (2)将目标病毒特异性单抗在酶标板上的固定备用，并将多余的活性位点用牛血清蛋白封闭； (3)将待检样品加到步骤(2)所制得的酶标板上，孵育一段时间，若待检样品中含有目标病毒，则会与酶标板上的单抗结合，用无菌的去离子水清洗后，目标病毒被固定在酶标板上; (4)将步骤(1)制得的KMnF4纳米探针悬浊液加到步骤(3)固定了目标病毒的酶标板上，若存在目标病毒则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有结合的探针就被洗掉；若不存在目标病毒，则所有探针都被洗掉； (5)用洗脱剂将酶标板上的双抗夹心的探针洗下来，如果还存在探针就是抓到目标病毒的探针； (6)步骤(5)所得的探针的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定；以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样品中有目标病毒；探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标病毒的量。2.根据权利要求1所述的基于KMnF4纳米探针的NMR病毒快速检测方法，其特征是所述探针为纳米级KMnF4材料，其纳米粒径小于500纳米。3.根据权利要求1所述的基于KMnF4纳米探针的NMR病毒快速检测方法，其特征是所述核磁共振弛豫时间，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
【专利摘要】一种基于KMnF4纳米探针的NMR病毒快速检测方法，属于食品安全快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于样品中病毒的核磁共振检测方法，利用KMnF4纳米探针的顺磁特性对核磁共振弛豫时间的影响，检测出样品中是否含有病毒。不同的具体的对应关系为：KMnF4纳米探针，在一定条件下显示出线性关系，即KMnF4纳米探针含量大，样品的自旋-晶格弛豫时间值越小，在一定范围能够定量检测病毒。本发明可以用于样品中病毒的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105424938
【申请号】CN201510750082
【发明人】张锦胜, 万益琴, 彭红, 刘玉环, 王允圃, 巫小丹
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月9日